引言
外泌體糖蛋白參與許多關(guān)鍵的生理和病理過程，如信號傳遞、免疫抑制以及腫瘤轉(zhuǎn)移等。外泌體蛋白的糖基化定義了相關(guān)蛋白的功能，進而決定了外泌體在細胞交流中的信號傳導(dǎo)特性。因此外泌體蛋白糖基化的表征對于外泌體的進一步生物應(yīng)用是十分必要的。此前研究外泌體蛋白糖基化的策略如凝集素法和質(zhì)譜法等，需要從外泌體釋放靶標蛋白，不能保證外泌體的完整性，因此不適用于生理狀態(tài)下外泌體蛋白糖基化的研究。糖代謝標記（MGL）法可通過細胞培養(yǎng)和隨后的化學偶聯(lián)將化學功能基團轉(zhuǎn)移到細胞膜多糖中，從而不顯著影響細胞的完整性和功能。但到目前為止，MGL還未在外泌體蛋白糖基化的研究上得到應(yīng)用。 成果簡介 近期，廈門大學化學化工學院楊朝勇教授團隊在《Angew. Chem. Int. Ed.》上發(fā)表了題為“Coupling Aptamer-based Protein Tagging with Metabolic Glycan Labeling for In Situ Visualization and Biological Function Study of Exosomal Protein-Specific Glycosylation”的研究論文。在該研究中他們開發(fā)了一種基于蛋白特異性適配體標簽和糖代謝標記（ExoAp-MGL）的雙標記策略來實現(xiàn)外泌體蛋白糖基化的原位可視化。他們選擇外泌體程序性細胞死亡配體1（exoPD-L1）作為研究靶點，首先利用MGL對外泌體表面唾液酸進行糖代謝標記，接著利用點擊化學反應(yīng)引入DBCO-Cy5，用Cy3標記的PD-L1適配體對PD-L1進行識別。然后通過Cy5與Cy3之間的FRET信號實現(xiàn)對同一外泌體上蛋白糖基化的原位表征。 圖文解讀 示意圖1. ExoAp-MGL 策略用于表征外泌體PD-L1（exoPD-L1）糖基化的示意圖。 A) 細胞用Ac4ManNAz培養(yǎng)后分泌含有疊氮化唾液酸的外泌體。B) 炔基熒光染料DBCO-Cy5通過點擊化學反應(yīng)與疊氮唾液酸進行生物正交反應(yīng)，對其進行標記。C) Cy3標記的PD-L1適配體用于PD-L1蛋白的識別。D) 利用Cy3標記的PD-L1適配體和DBCO-Cy5標記的唾液酸之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移實現(xiàn)exoPD-L1的原位熒光成像。 圖1. 代謝標記的A375人黑色素瘤細胞外泌體的鑒定以及PD-L1識別分子（適配體和和抗體）的結(jié)合特性表征。A) 糖代謝標記外泌體的透射電鏡（TEM）表征。B) 代謝標記的外泌體尺寸數(shù)據(jù)。C) 抗體染色實驗結(jié)果表明標準外泌體和代謝標記的外泌體具有相近的外泌體標志物CD63，以及免疫檢查點PD-L1表達量。D) 免疫印跡實驗對代謝標記的外泌體PD-L1表達量以及去糖基化的分析。以上結(jié)果說明糖代謝標記不會對外泌體的性質(zhì)產(chǎn)生明顯影響。E) PD-L1抗體與PD-L1適配體結(jié)合性能的流式細胞分析，說明MGL不影響抗體或適配體對PD-L1的識別。F) PD-L1適配體對exoPD-L1與PD-1相互作用的影響。 圖2. exoPD-L1 糖基化的可視化。A) 疊氮化唾液酸外泌體與炔基熒光染料DBCO-Cy5的生物正交反應(yīng)示意圖。B) 用Ac4ManNaz處理/不處理的A375細胞與DBCO-Cy5孵育后外泌體的熒光強度，結(jié)果表明DBCO和疊氮化唾液酸外泌體的生物正交反應(yīng)的成功進行。C) 共聚焦成像結(jié)果表明只有在DBCO-Cy5 和Cy3標記的PD-L1 適配體共孵育后才會有FRET信號，進一步驗證了ExoAp-MGL策略的可行性。 圖3. exoPD-L1糖基化對其與PD-1相互作用的影響。A) 代謝標記的糖基化和去糖基化外泌體先后用DBCO-Cy5和Cy3標記的PD-L1適配體標記，然后與PD-1受體共孵育后的原位共聚焦成像。B) 共聚焦成像中熒光強度的定量分析。C) PD-1染色的熒光信號與FRET信號的皮爾遜相關(guān)性分析。以上結(jié)果表明了糖基化是外泌體PD-L1與PD-1相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在兩者相互作用中發(fā)揮著重要作用。 圖4. exoPD-L1糖基化對CD8+ T細胞識別和抑制的影響。A) 代謝標記的外泌體用/不用PNG酶F處理，再用Cy3標記的PD-L1 適配體和DBCO-Cy5標記，并與CD8+T細胞共孵育后進行共聚焦成像，用eFluor450標記的CD8抗體鑒定CD8+T細胞。結(jié)果表明糖基化有利于PD-L1對PD-1表達的CD8+T細胞的識別。B) 代謝標記的糖基化/去糖基化外泌體與CD8+T細胞共孵育后細胞數(shù)量變化分析，說明exoPD-L1糖基化可能有助于抑制CD8+T細胞的增殖。C) exoPD-L1糖基化影響對CD8+T細胞識別和抑制其增殖的可能機理。 總結(jié)與展望 作者簡介 楊朝勇，國家杰出青年科學基金獲得者、廈門大學特聘教授、上海交通大學分子醫(yī)學研究院副院長、譜學分析與儀器教育部重點實驗室副主任、中國化學會化學生物學專業(yè)委員會副主任、美國化學會ACS Applied Bio Materials 副主編。于2006年在美國佛羅里達大學獲得博士學位，2006年9月至2007年12月在美國加州大學伯克利分校從事博士后研究。 主要研究領(lǐng)域未生物分析化學，在分子探針、微流控芯片、信號放大、單細胞分析等方向取得了創(chuàng)新性的成果。 宋彥齡，廈門大學化學化工學院教授。主要研究方向為分子定向進化、微納界面組裝及識別機制、微流控分析、液體活檢、單細胞分析、生物傳感。 文獻鏈接 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202103696 編輯：龔波 審核：田風玉 推送：袁燕燕
