今天給大家分享的是最近在JACS上發(fā)表的文章，題為：Live-Cell Protein Modification by Boronate-Assisted Hydroxamic Acid Catalysis。該工作的通訊作者是來(lái)自東京大學(xué)醫(yī)藥研究生院的Shigehiro A. Kawashima教授、Kenzo Yamatsugu教授和Motomu Kanai教授。
真核細(xì)胞內(nèi)的許多過(guò)程都受到蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(PTMs)所調(diào)控，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性和轉(zhuǎn)錄等等,，因此在活細(xì)胞內(nèi)選擇性地進(jìn)行PTMs是研究其功能的有利方法。其中非生物催化是一種不需要基因操作、且能提供最廣泛的非天然PTMs的方法，但目前實(shí)現(xiàn)有用的反應(yīng)性和選擇性仍是一個(gè)未解決的挑戰(zhàn)。
在之前的工作中，該課題組報(bào)告了DSH的催化劑系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)區(qū)域選擇性的蛋白質(zhì)賴(lài)氨酸的?；?span style="font-variant-numeric: normal; font-variant-east-asian: normal; font-stretch: normal; line-height: normal; font-family: "Times New Roman";">(如圖1a)。然而將其應(yīng)用于活細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)高濃度的硫醇會(huì)導(dǎo)致硫酯的中間體猝滅，因此反應(yīng)過(guò)程中需要用 GSH 生物合成抑制劑和毫摩爾級(jí)濃度的硫酯試劑處理細(xì)胞。
為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者在本文中報(bào)告了硼酸鹽輔助的羥肟酸 (BAHA) 的催化體系(如圖1b)。在該設(shè)計(jì)中，二醇與含硼酸的?；w可逆結(jié)合以形成硼酸酯，隨后由于局部濃度的提高，迅速地向路易斯堿發(fā)生分子內(nèi)的?；D(zhuǎn)移，產(chǎn)生了反應(yīng)中間體。通過(guò)選擇性?xún)?yōu)化含硼酸的?；w和二醇化合物，得到最優(yōu)的賴(lài)氨酸?；a(chǎn)率，并將其應(yīng)用到活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾。
圖1. (a)使用硫酯交換的DSH催化劑系統(tǒng);(b)利用可逆硼酸鹽的形成的BAHA催化劑體系
作者首先通過(guò)HPLC評(píng)估了不同的?；w，最后選擇D2作為乙?；噭?，因?yàn)樗鼉A向于酰胺化反應(yīng)而不是硫酯的形成。隨后作者以先前報(bào)道的羥肟酸路易斯堿與賴(lài)氨酸殘基和二醇的共價(jià)偶聯(lián)物作為模型底物，調(diào)整了不同的催化劑結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在D2的存在下通過(guò)HPLC檢測(cè)賴(lài)氨酸的乙?；^(guò)程。結(jié)果表明硼酸鹽的形成和路易斯堿的催化對(duì)有效乙酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)起到協(xié)同作用，二者缺一不可。
基于此，作者合成了催化劑6，它配備了甲氧芐啶 (TMP)，這是一種大腸桿菌二氫葉酸還原酶 (eDHFR)的配體(如圖2)。在6和D2的存在下，eDHFR-GFP成功地實(shí)現(xiàn)了位點(diǎn)特異性(K32)的乙?；?。此外，該反應(yīng)可耐受各種潛在的抑制劑，包括5 mM GSH、HeLa細(xì)胞質(zhì)提取物、多巴胺、D-果糖和20當(dāng)量的反應(yīng)副產(chǎn)物。
圖2. eDHFR K32的體外乙?；磻?yīng)。反應(yīng)條件：10μM eDHFR-GFP, 2μM 6, 0.2mM的D2, 50mM磷酸鹽, pH 7.5, 37℃, 4小時(shí)
接下來(lái)，作者使用重組表達(dá)的eDHFR-GFP(細(xì)胞內(nèi)約 30 μM)作為靶標(biāo)，在活細(xì)胞HEK293T中測(cè)試了BAHA系統(tǒng)的乙?；磻?yīng)性。不幸的是，在5 μM 6和100 μM D2存在下，5小時(shí)后僅得到了22%的乙?；磻?yīng)產(chǎn)物。作者認(rèn)為這是由于催化劑6的高親水性和分子量可能會(huì)損害其藥代動(dòng)力學(xué)方面的性質(zhì)，例如膜滲透性或代謝穩(wěn)定性。因此作者合成了更加疏水的催化劑，結(jié)果產(chǎn)量得到了大大的提高，且間位的催化劑的產(chǎn)率最高(80%)，然而其中緣由作者尚不清楚。
圖3. HEK293T細(xì)胞內(nèi)eDHFR-GFP酰化的范圍。反應(yīng)條件：1 μM 8, 100 μM ?；w, 37 °C, 5小時(shí)
最后，作者在HEK293T細(xì)胞中探究了BAHA系統(tǒng)介導(dǎo)的賴(lài)氨酸?；孽；w范圍(如圖3)。結(jié)果顯示，內(nèi)源性的PTM的產(chǎn)率都很高——乙?；?span style="font-variant-numeric: normal; font-variant-east-asian: normal; font-stretch: normal; line-height: normal; font-family: "Times New Roman";">(D4;82%)和丁?；?span style="font-variant-numeric: normal; font-variant-east-asian: normal; font-stretch: normal; line-height: normal; font-family: "Times New Roman";">(D5;79%)。帶有炔烴(D6;74%)和疊氮化物(D7;72%)反應(yīng)性手柄的?；w也得到了很高的產(chǎn)率;此外，帶有光反應(yīng)性二氮嗪基團(tuán)(D8;69%)的供體也是有效的，含硫醚的供體(D9)的酰化也以63%的產(chǎn)率實(shí)現(xiàn)，鏈霉親和素(D10;62%)、含氟化合物(D11;49%)、低聚乙二醇(D12;52%)的酰基也是可能的。然而含有帶電官能團(tuán)的酰基供體不成功，可能是由于膜滲透性低。
綜上所述，作者開(kāi)發(fā)了一種用于活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)賴(lài)氨酸?；?span style="font-variant-numeric: normal; font-variant-east-asian: normal; font-stretch: normal; line-height: normal; font-family: "Times New Roman";">BAHA催化劑系統(tǒng)。BAHA的催化劑和試劑相互作用，使其可以以微摩爾濃度反應(yīng)，且具有良好的選擇性，不受細(xì)胞內(nèi)的GSH 影響，提供了一種在活細(xì)胞中安裝天然和非生物賴(lài)氨酸 PTM 的方法。
作者：LJH 審校：ZZC
DOI: 10.1021/jacs.1c07060
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c07060
