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摘要
在合成和生物催化領域中，可以催化脂肪族碳的鹵化酶引起了極大的興趣。該文闡明了AoiQ的反應機理，AoiQ是一種黃素依賴性鹵化酶（FDH），在dichlorodiaporthin生物合成過程中，可催化1,3-二酮底物的偕二鹵化反應。 AoiQ是第一個通過體外生化實驗闡明能夠鹵化脂肪族底物的FDH。
02 內容 鹵代化合物的應用范圍很廣，當今許多最暢銷的藥物和農用化學品都含有鹵素原子。鹵代可以改善生物活性，此外，鹵素化合物也是在有機合成中的重要作用。通常，諸如甲基的脂族烴的碳氫鍵是化學惰性的，如何區(qū)域選擇型的引入鹵原子是現在催化學家們的研究熱點。自然界中，通常non-heme-鐵依賴型的α-kg鹵化酶通過自由基的機制催化惰性碳氫鍵鹵化反應。FDH通過親電取代機制催化芳香族鹵化反應，而關于其催化碳氫鍵的鹵化報道較少。Chankhamjon等人前期報道了一種雙功能FDH-MT融合蛋白AoiQ催化orthosporin (4) 的氯化反應產生化合物1-3?；衔?/span>4氯化位點的碳氫鍵是惰性的，在C11生成親核試劑有悖于傳統(tǒng)的FDH的親電取代機制。作者推測AoiQ通過自由基機理催化4到2的氯化。因此，進一步研究鹵化機制十分必要。 Chankhamjon前期報道aoiQ和diaporthin的生物合成基因簇aoi位于不同的染色體上。在對AoiQ的研究中，作者發(fā)現aoiQ位于另一BGC（dia）中，該簇編碼NRPKS（diaA），內酰胺（diaB），SDR diaC和FMO diaD。生物信息學分析發(fā)現dia同源簇保守存在于其他真菌中，包括dichlorodiaporthin的產生菌株，但aoi不保守。 為了驗證AoiQ在aoi和dia基因簇中的功能，作者在A. nidulans中異源表達了這兩個簇。當aoiG和aoiF與 aoiQ共表達時，未觀察到氯化產物，而觀察到了單和二甲基化的diaporthin 化合物5和7。相反，當DiaA和DiaB與 aoiQ共表達時，可以觀察到氯化產物1。這些結果表明， dia是dichlorodiaporthin的實際生物合成基因簇。由于A. nidulans也具有該簇，因此作者在酵母中進一步異源表達該簇以避免cross-talk。當表達DiaA和DiaB時，作者可以觀察到6及其還原產物8和9，8和9由內源性還原酶催化的。 6具有1，3-二酮部分，其可以作為dichlorodiaporthin的前體。因此，作者共表達了DiaAB與AoiQ，然而只能檢測到痕量的1，而6被完全消耗。當共表達DiaC SDR時，可以觀察到1作為主要氯化產物。因此，作者推測SDR的原本功能是還原AoiQ的催化產物。當表達DiaABC時，僅觀察到C10還原的化合物8，表明DiaC區(qū)域選擇性的還原C10酮羰基。 接著，作者分別體外表達了AoiQ的MT和FDH結構域蛋白。當 AoiQ-FDH和DiaC酶與底物6進行體外反應時，可以檢測到鹵代產物產物2和12，證實了二酮是AoiQ的實際底物。 由底物6轉化成2需要經過氯化，脫乙酰和酮還原反應。 為了解脫?；襟E，作者化學合成了化合物15，在體外反應緩沖液中， 15自發(fā)轉化為α-鹵代酮16，這表明脫乙?；磻獮榉敲复俜磻?/span>。 添加AoiQ-FDH和DiaC可產生 2，這表明15為生物合成中間體。該反應可能是由水攻擊 β-羰基，然后消除a-鹵代羰甲基而發(fā)生的。 當作者在構巢曲霉中共表達DiaAB和AoiQ-FDH時，作者觀察到三氯代化合物19，其中5位被氯化。這一結果表明，AoiQ-FDH還可以催化芳香族氯化反應。體外測定表明AoiQ-FDH可將 2轉化為19；也可將4，8，12分別轉化為相應的C5或C7氯代化合物。該結果表明二酮底物中的C11是優(yōu)選的親核試劑，二酮部分的缺失會導致其他親核試劑的氯化。由于具有不同氯化位置的化合物的保留時間和質量相似，這可能導致是前期報導對AoiQ可作用未活化的sp3碳誤解的原因。 總而言之，該文報道了單組分FDH AoiQ可催化可烯化的1，3-二酮底物發(fā)生偕二鹵代反應，繼而導致罕見聚酮縮短反應。對 AoiQ作用機制的研究對拓展其用于生物催化領域生產鹵代非芳香化合物奠定了基礎。 華中科技大學藥學院張勇慧教授團隊博士生劉夢婷為該文的第一作者。加州大學洛杉磯分校（UCLA）的Yi Tang教授，Masao Ohashi 研究員以及HKI的Christian Hertweck教授為該文的通訊作者 。
