今天跟大家分享一篇發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章，文章題目是“Electrochemical Immunosensor for Cardiac Troponin I Detection Based on Covalent Organic Framework and Enzyme-Catalyzed Signal Amplification”，本文的通訊作者是來(lái)自中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的楊秀榮院士，主要從事電分析化學(xué)、分子識(shí)別和生物分子相互作用及微流控分析化學(xué)的研究。本文提出了一種使用多功能共價(jià)有機(jī)骨架納米復(fù)合材料（HRP-Ab2-Au-COF）作為信號(hào)放大探針的高靈敏度電化學(xué)免疫傳感器，用于測(cè)定心肌肌鈣蛋白 I（cTnI）。提供了一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)定量測(cè)定實(shí)際樣品中的 cTnI，并拓寬了基于 COF 的納米復(fù)合材料在電化學(xué)免疫傳感器中的應(yīng)用范圍。
急性心肌梗死（AMI）是冠心病中最嚴(yán)重的一種，對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅。迄今為止，肌酸激酶-MB、肌紅蛋白、C反應(yīng)蛋白和cTnI是診斷AMI的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。其中，cTnI是臨床應(yīng)用中特異性最強(qiáng)、窗口期最長(zhǎng)的生物標(biāo)志物，被認(rèn)為是AMI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。因此，開(kāi)發(fā)一種快速靈敏的分析方法來(lái)檢測(cè) cTnI 至關(guān)重要。基于抗原和抗體之間高特異性鑒定的免疫學(xué)檢測(cè)是生物標(biāo)志物定性和定量檢測(cè)的重要分析方法。目前，許多基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的免疫測(cè)定方法，如化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法、熒光法、表面增強(qiáng)拉曼散射法和比色法，已應(yīng)用于cTnI檢測(cè)。與上述方法相比，電化學(xué)免疫傳感器以其響應(yīng)速度快、選擇性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注。近年來(lái)，各種納米材料已被用于設(shè)計(jì) cTnI 電化學(xué)免疫傳感器以提高檢測(cè)靈敏度。因此，設(shè)計(jì)新型功能納米材料并構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器以快速、選擇性和靈敏地測(cè)定 cTnI 具有重要意義和緊迫性。共價(jià)有機(jī)骨架（COF）是一種通過(guò)共價(jià)鍵將有機(jī)結(jié)構(gòu)單元連接在一起，形成具有周期性結(jié)構(gòu)的多孔結(jié)晶骨架的材料。它具有比表面積大、孔徑可調(diào)、孔隙率高、毒性低、生物相容性好等諸多獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。因此，COFs 已被用于許多研究領(lǐng)域，如藥物遞送、分離、催化、氣體吸附和儲(chǔ)存等。近年來(lái)，具有獨(dú)特多孔、電子和機(jī)械性能的 COFs 已與其他電活性材料一起功能化，以設(shè)計(jì)各種信號(hào)放大策略以提高電化學(xué)免疫傳感器的分析性能。然而，基于 COF 的 cTnI 電化學(xué)免疫傳感器的開(kāi)發(fā)仍處于起步階段。基于上述背景，設(shè)計(jì)了一種基于COF的信號(hào)探針，首次用于cTnI的夾心式電化學(xué)免疫分析。構(gòu)建的電化學(xué)信號(hào)探針HRP-Ab2-Au-COF集靶點(diǎn)識(shí)別和信號(hào)放大功能于一體，COF表面負(fù)載的金納米粒子增強(qiáng)了電導(dǎo)率，促進(jìn)了抗體(Ab2)的結(jié)合。當(dāng)引入目標(biāo) cTnI 時(shí)，HRP-Ab2-Au-COF 通過(guò)抗體-抗原相互作用固定在電極表面，其中 H2O2-HRP 系統(tǒng)催化氧化氫醌 (HQ) 生成苯醌 (BQ)，然后進(jìn)一步還原生成苯醌 (BQ)電化學(xué)信號(hào)。該生物傳感器對(duì) cTnI 具有良好的分析性能，檢測(cè)限為 1.7 pg/mL，在實(shí)際樣品中的檢測(cè)結(jié)果令人滿意，表明其在臨床分析中目標(biāo)蛋白的測(cè)定方面具有突出的應(yīng)用前景。
方案1簡(jiǎn)要說(shuō)明了HRP-Ab2-Au-COF的制備過(guò)程和電化學(xué)免疫傳感器的組裝過(guò)程。首先，通過(guò)簡(jiǎn)單的液相合成方法在室溫下由 TAPB 和 DMTP 制備球形 COF，在 NaBH4 通過(guò) Au-NH2 結(jié)合還原的情況下，金納米粒子在 COF 表面原位生長(zhǎng)。然后，Ab2 通過(guò) Au-NH2 反應(yīng)與金納米粒子結(jié)合。之后，HRP 通過(guò)主客體相互作用嵌入 COF 的孔中。值得注意的是，COF 在連接金納米粒子、Ab2 和 HRP 方面發(fā)揮了重要作用。此外，金納米粒子具有優(yōu)異的導(dǎo)電性，可以提高生物傳感器的靈敏度。由于COF的高孔隙率，大量的HRP分子被引入到納米復(fù)合材料中，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)簽從一對(duì)一到一對(duì)多的轉(zhuǎn)化模式。HRP與Ab2標(biāo)記的COF結(jié)合，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)識(shí)別和信號(hào)放大。為了檢測(cè) cTnI，首先通過(guò) Au-NH2 結(jié)合將捕獲抗體 Ab1 固定在裸 GE 的表面。用 BSA 封閉多余的活性位點(diǎn)后，修飾電極與不同濃度的 cTnI 孵育。最后，制備的 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶聯(lián)物被 cTnI 捕獲。將修飾電極浸入電解液中后，H2O2 可以有效地將 HRP 氧化為 HRPOx，進(jìn)而將 HQ 氧化為 BQ 并再生 HRPRed。接下來(lái)，BQ 在電極表面周?chē)贿€原并產(chǎn)生明顯的電化學(xué)信號(hào)。通過(guò)這種 H2O2-HRP-HQ 催化循環(huán)，可以獲得放大的電流信號(hào)，并將設(shè)計(jì)的生物傳感器應(yīng)用于 cTnI 的定量檢測(cè)。
SEM 和 TEM 用于表征 COF 材料的形態(tài)。COF 顯示出均勻的球形形態(tài)，表面粗糙（圖 A、B）。在 COF 上原位生長(zhǎng)的金納米粒子大小約為 2.5 nm，分布均勻（圖 D、F）。值得注意的是，在金納米粒子生長(zhǎng)和負(fù)載蛋白質(zhì)后，Au-COF 和 HRP-Ab2-Au-COF 的形態(tài)（圖 C-F）與 COF 相比保持不變。然而，與 COF (294.1 nm) 相比，Au-COF 和 HRP-Ab2-Au-COF 的流體動(dòng)力學(xué)尺寸分別逐漸增加至 336.6 和 423.7 nm。COF 的 BET 表面積計(jì)算為 386.7 m2/g。此外，根據(jù) NLDFT 分析，COF 的孔體積和平均孔徑分別約為 0.56 cm3/g 和 2.88 nm。
HRP-Ab2-Au-COF 的元素映射顯示 Au 和 Fe 的均勻分散（圖 A），表明 Au 納米顆粒和 HRP 成功與 COF 結(jié)合。Au 4f 的 XPS 光譜如圖 B 所示。84.17 和 87.82 eV 的兩個(gè)峰分別歸因于 Au 4f7/2 和 4f5/2。根據(jù) ICP-OES 結(jié)果，Au 和 Fe 的含量分別約為 7.62% 和 0.063%。以上分析結(jié)果均證實(shí)了HRP-Ab2-Au-COF納米復(fù)合材料的成功合成。
為了確保傳感方法的可行性，進(jìn)行了 CV 和 EIS 實(shí)驗(yàn)來(lái)研究電極修改程序。如圖 A 所示，裸 GE 顯示出一個(gè)非常小的半圓，這證明了其出色的導(dǎo)電性。固定Ab1，用BSA封閉，捕獲cTnI后，電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct）依次增加，這是由于非電活性蛋白質(zhì)抑制了電子轉(zhuǎn)移。隨后，在與 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶聯(lián)物結(jié)合后，Rct 進(jìn)一步增加。此外，在沒(méi)有 cTnI 的情況下，與 HRP-Ab2-Au-COF 孵育的修飾電極顯示出與 BSA/Ab1/GE 相似的 Rct（曲線 d），表明可忽略不計(jì)的 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶聯(lián)物非特異性吸附在電極表面。圖 B 中相應(yīng)的 CV 曲線顯示，在逐步修改 Ab1、BSA、cTnI 和 HRP-Ab2-Au-COF 后，峰值電流降低，峰間分離度增加，這與 EIS 的結(jié)果一致。此外，圖 C 顯示了所提出的電化學(xué)生物傳感器在含有 HQ 和 H2O2 的 PBSI 溶液中有或沒(méi)有目標(biāo) cTnI 的 DPV 曲線。在沒(méi)有 cTnI 的情況下，生物傳感器在 -0.064 V 處顯示出很小的電流響應(yīng)。然而，隨著 1 ng/mL 目標(biāo) cTnI 的加入，由于 H2O2-HRP-HQ 介導(dǎo)的信號(hào)放大，電流顯著增加了 4.6 倍.這些結(jié)果證明了所提出的生物傳感器的成功組裝和可行性。
在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)測(cè)量 DPV 響應(yīng)電流來(lái)研究 cTnI 的濃度。從圖 6A、B 中可以看出，生物傳感器的 DPV 電流信號(hào)隨著 cTnI 濃度的增加而增強(qiáng)。響應(yīng)電流在5 pg/mL～10 ng/mL范圍內(nèi)與cTnI濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9918。同時(shí)，計(jì)算出的檢測(cè)限為 1.7 pg/mL (S/N = 3)。在臨床研究中，cTnI 濃度在 0.5 至 2.0 ng/mL 之間被視為正常人和患者的分界線。因此，該方法可用于檢測(cè)實(shí)際樣品中的 cTnI。 總之，構(gòu)建了一個(gè)基于COF的電化學(xué)生物傳感平臺(tái)用于cTnI的定量測(cè)定。鑒于高孔隙率的優(yōu)勢(shì)，大量的HRP被封裝在COF中，可以在H2O2的幫助下有效地促進(jìn)HQ氧化為BQ，進(jìn)而顯著放大BQ的電化學(xué)還原信號(hào)。同時(shí)，COF良好的生物相容性可以保持酶的活性和穩(wěn)定性。此外，在 COF 表面原位生長(zhǎng)的金納米粒子不僅有利于 Ab2 的固定，而且還提高了電導(dǎo)率。結(jié)合上述優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè) cTnI 的線性范圍為 5 pg/mL 至 10 ng/mL，檢測(cè)限為 1.7 pg/mL，并表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性和重現(xiàn)性。所提出的免疫傳感器成功地用于實(shí)際樣品測(cè)定，顯示出良好的回收率和重現(xiàn)性?？傊?，我們構(gòu)建的基于 COF 的電化學(xué)免疫傳感器可以成為檢測(cè)其他生物標(biāo)志物的通用方法。
