今天為大家分享一篇發(fā)表在Angew上的文章，文章的題目是“Supernova: a deoxyribozymethat catalyzes a chemiluminescent reaction”，通訊作者是來自捷克科學院的Edward Curtis教授，他的實驗室主要研究功能性RNA和DNA。在這篇文章中作者篩選得到了一種可以催化化學發(fā)光反應的DNA核酶。
20世紀80年代核酶被發(fā)現(xiàn)以來，已經有多種具有催化能力的RNA和DNA分子被報道，他們被廣泛應用于包括插入特定序列、檢測生物小分子如ATP在配體存在下產生熒光信號等方面。在生物傳感器中，光信號具有便宜好用、安全性高等特點，作者因此希望開發(fā)一種可以催化產生光信號的核酶系統(tǒng)。作者注意到一種基于1,2-二氧乙烷結構的發(fā)光小分子CDP-Star，其發(fā)光基團被磷酸基封閉，當磷酸基去除后則會產生光信號。CDP-Star被廣泛應用于磷酸酶的檢測中，在之前的研究中，已經報道了可以催化磷酰轉移的核酶，因此作者認為通過核酶發(fā)生自磷酸化，從而轉移掉CDP-Star的磷酸基使其發(fā)光的思路是可行。
作者首先對能轉移CDP-Star磷酸基的核酶進行了篩選。作者首先將1016個單鏈DNA分子與CDP-Star共孵育，然后通過T4連接酶在DNA的5`端連接上用于后續(xù)PCR的引物。由于T4連接酶不能識別5`端羥基的DNA，因此在這一步中只有能轉移磷酸基的DNA會被連接上引物。作者隨后通過PAGE純化、PCR、磷酸外切酶得到了目標DNA，其5`端磷酸可以被水解酶再生，用于下一輪的篩選。經過9輪篩選后，作者得到了一系列具有高催化活性的克隆。
為了進一步提高催化活性并了解催化活性與序列的關系，作者進一步使用了人工進化的方法。作者通過化學合成，在每個位置以21%的概率生成隨機突變，最終生成了約135000個不同的脫氧核酶。這些脫氧核酶相比于最初的核酶具有高6倍的催化速率，且它們的序列中有3段高度保守的序列。序列對比顯示出這些脫氧核酶具有一個獨特的三螺旋結構，而該結構又被一個四堿基三聯(lián)體結構固定。隨后作者對緩沖液中金屬離子的影響進行研究，結果證明該催化過程還需要鋅離子參與，作者推測其催化機理與堿性磷酸酶類似。
最后作者對這套系統(tǒng)的發(fā)光能力進行了研究。結果顯示只需要~10 nM的底物CDP-Star就可以產生光信號，而該信號的線性范圍則橫跨1 uM到3000 uM，且對底物特異性很高。另外作者還檢測了該系統(tǒng)的應用價值，作者首先將其應用在了對特定序列核酸的檢測上，通過在脫氧核酶的可變區(qū)和3`端添加用于檢測的互補序列，作者成功實現(xiàn)了對特定序列的定量檢測。
綜上所述作者通過篩選和人工進化的方法，開發(fā)了一套包含脫氧核酶和CDP-Star的化學發(fā)光系統(tǒng)，并將其應用在了特定核酸的檢測中。該方法具有成本較低、易于改造等優(yōu)點，作者相信它會在傳感器或DNA邏輯電路中發(fā)揮重要作用。
本文作者：LYP
責任編輯：Guo ZH
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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202109347
原文引用：DOI：10.1002/anie.202109347
