硫肽抗生素是一類富含硫、高度修飾的肽類天然產(chǎn)物，具有強大的抗感染活性。根據(jù)氧化態(tài)和中心六元雜環(huán)的不同，硫肽類抗生素分為5個亞族，即a型的哌啶(硫肽素A)、b型的脫氫哌啶(硫鏈絲菌肽)、c型的咪唑哌啶(Sch40832)、d型的吡啶(硫西林I)和e型的羥基吡啶(那西肽)(Figure 1A)。目前，對a、b、d和e四種類型的硫肽的生物合成途徑研究較多，在形成機制上，其核心氮雜六元環(huán)均起始于[4+2]環(huán)加成反應，后通過脫水和加氫形成b型脫氫哌啶環(huán)，若繼續(xù)加氫則形成a型飽和哌啶環(huán)；若環(huán)加成后發(fā)生脫水和脫除前導肽，則形成d型吡啶環(huán)，進一步羥化形成e型羥基吡啶環(huán)。但對于核心結(jié)構(gòu)最為復雜的二氫咪唑并哌啶的c型硫肽，其酶促合成機理尚不明確。近期，中國科學院上海有機化學研究所劉文研究員團隊基于對Micromonospora carbonacea ATCC 39149相關(guān)基因的挖掘和表征，利用異源表達和體外生化實驗，解析了c型硫肽類抗生素生物合成中二氫咪唑并哌啶形成的酶促過程：b型硫肽核心環(huán)首先被SchZ還原為a型硫肽核心環(huán)，緊接著在SchY催化下，哌啶與相鄰噻唑發(fā)生氧化重排形成并環(huán)，生成c型硫肽中間產(chǎn)物。SchX和SchW則分別對并環(huán)上的巰基和醛基進行甲基化和還原，以形成穩(wěn)定的成熟硫肽分子。
(A) 硫肽類抗生素中心雜環(huán)的結(jié)構(gòu)； (B) 與 Sch40832 相關(guān)的基因簇、生物合成途徑和結(jié)構(gòu)(藍色代表咪唑哌啶形成，綠色代表糖基化)。首先利用生物信息學分析從M. carbonacea ATCC 39149(即 CP058905)基因組序列中鑒定了一個基因簇(sch，Figure 1B)，推測其負責 Sch40832 的生物合成。與高度同源基因簇tsr(負責b型硫肽的合成)和 tpp(負責a和b型硫肽的合成)比對，定位了四個緊密聚集的基因schV(編碼糖基轉(zhuǎn)移酶)、schW(編碼NADPH依賴的還原酶)、schX(編碼甲基轉(zhuǎn)移酶)和schY(編碼P450酶)(Figure 1B)。由于M. carbonacea菌株無法進行基因操作，研究人員將基因schW、schX和schY以及它們的不同組合引入硫鏈絲菌素產(chǎn)生菌Streptomyces laurentii的突變體SL1051中(Figure 3B, 左)，遺憾的是，這些重組菌株均不能轉(zhuǎn)化硫肽前體1(Figure 3A)，表明脫氫哌啶單元不是咪唑哌啶合成的直接前體。
隨后，對基因簇sch進一步分析發(fā)現(xiàn)了一個遠離基因schWXY(Figure 1B)的schZ基因，編碼F420依賴的氧化還原酶。為驗證schZ的功能，將該基因引入SL1051，通過HPLC和HR-MS(Figure 3B, 右)檢測產(chǎn)物的變化。結(jié)果顯示，大部分前體1轉(zhuǎn)化為+2 Da的產(chǎn)物2([M+H]+m/z: 1681.5162，C73H89N18O19S5)。通過NMR進一步分析純化的產(chǎn)物2(Figure 3A)，發(fā)現(xiàn)2和1在1H和13C NMR中高度相似，差異在于核心中心環(huán)。根據(jù)HMBC 和 1H-1H COSY相關(guān)，確定2為1的衍生物，含有飽和哌啶環(huán)(Figure 3A)。接著，在大腸桿菌中過表達SchZ并在體外測定其活性，結(jié)果如預期，在存在TppX5的情況下SchZ可以催化產(chǎn)物1到2的還原(Figure 2和4A)?；诖私Y(jié)果，研究人員又在該重組菌株中繼續(xù)引入了schW、schX和/或schY，以探索是否可以發(fā)生進一步的轉(zhuǎn)化(Figure 3B, 右)，發(fā)現(xiàn)除了1和2之外，只有共表達schWXYZ的重組菌株產(chǎn)生了少量的新產(chǎn)物(3，[M+H]+ m/z: 1713.5431，C74H93N18O20S5)。核磁解析分析3中含有咪唑哌啶單元，為c型硫肽。因此，推測SL1051內(nèi)中心雜環(huán)由SchWXY催化含哌啶的硫肽中間體2形成。
Figure 3. 菌株S. laurentii中產(chǎn)物及其衍生物檢測 (A) 硫鏈絲菌肽及其衍生物 1、2和 3 的結(jié)構(gòu)； (B) 通過 HPLC ( λ = 254 nm) 分析 S. laurentii菌株的產(chǎn)物 (左：i，野生型；ii; ΔtsrB 突變體；和iii、iv 和 v，分別表達 schY、schYX 和 schYXW 的ΔtsrB 突變體。右：i；ΔtsrB 突變體；和 ii、iii、iv 和v，ΔtsrB 突變體，其中分別表達了 schZ、schYZ、schYXZ 和 schYXWZ)。
研究人員采用一鍋法合成驗證SchW、SchX和SchY是否能將2轉(zhuǎn)化為3(Figure 4C)。除了純化的SchW、SchX和SchY，反應混合物還包括SAM(作為甲基供體)、葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PD)(通過原位轉(zhuǎn)化葡萄糖6-磷酸(G6P)提供NADPH)以及鐵氧化還原蛋白(Fdx)和鐵氧化還原蛋白-NADP+還原酶(FdR)對(用于細胞色素P450 相關(guān)催化中的電子轉(zhuǎn)移)。觀察到化合物3的產(chǎn)生，表明SchWXY參與了從a型底物類似Sch40832的c型硫肽的合成。但與在schWXYZ共表達的SL1051重組菌株中的觀察結(jié)果一致，該轉(zhuǎn)化效率較低，推測可能歸因于SchY活性較差。于是挖掘了與SchY高度同源的AchY，編碼該蛋白的基因位于Actinoalloteichus hoggarensis DSM 45943中類似于sch基因簇(即ach)。以AchY替代SchY，在30°C下孵育6小時后，化合物2以時間依賴性轉(zhuǎn)化(Figure 4C)，且3的產(chǎn)量高于使用SchY時的產(chǎn)量，表明AchY在轉(zhuǎn)化2方面上比SchY更有效。
Figure 4. 通過 HPLC (λ = 254 nm) 檢測咪唑哌啶的形成。(A) SchZ 活性的體外測定。1在(i)滅活的 SchZ，(ii)SchZ中轉(zhuǎn)化，(iii)標準品 1和 (iv) 2； (B) 相關(guān)硫肽中間體/衍生物的中心雜環(huán)的結(jié)構(gòu)； (C) SchY、SchW 和 SchX 活性的體外測定。2在滅活的 AchY 和 SchXW (i)、SchYXW(ii)、AchY 和 SchXW (iii)、滅活的 AchY (iv)、AchY (v)、滅活的 AchY 和 SchX (vi)、AchY和 SchX (vii)，滅活的 AchY 和 SchW (viii)，以及AchY 和 SchW (ix)中轉(zhuǎn)化, 標準品2(x)和3(xi)。
為揭示AchY功能及咪唑哌啶的形成機制。將AchY單獨孵育后，發(fā)現(xiàn)約50%的產(chǎn)物2被消耗掉，但無明顯可見的新產(chǎn)物生成(Figure 4C)。推測AchY可能作為單加氧酶啟動咪唑哌啶的形成，通過選擇性催化硫肽大環(huán)外哌啶相鄰噻唑單元中的C4'-C5'環(huán)氧化(Figure 2)，接著哌啶的N1原子親核進攻生成C-N鍵，隨后C-S鍵裂解，得到帶有醛基和硫醇基團的咪唑哌啶雜環(huán)，這兩個基團都具有高反應性，可能會被反應混合物中的某些成分捕獲，降低預測產(chǎn)物4(一種不穩(wěn)定的c系列硫肽中間體)的可檢測性(Figure 4B)，導致反應中的HPLC-HR-MS只能顯示出痕量4([M+ H]+ m/z: 1697.5107，C73H89N18O20S5)(Figure 4B)。為證實該推測，在含有羥胺的混合物中進行AchY對2的催化轉(zhuǎn)化。正如預期，形成了4的+15 Da衍生物5([M+H]+m/z: 1712.5221，C73H90N19O20S5)(Figure 4B)。接著，在碘乙酰胺(IAA，一種硫醇衍生試劑)參與的反應混合物中產(chǎn)生了4的+72 Da衍生物6([M+ H]+m/z: 1769.5459，C75H93N20O21S5)(Figure 4B)，驗證了硫醇基團的存在。由此可見，AchY是一種咪唑哌啶合酶，通過氧化哌啶-噻唑單元介導結(jié)構(gòu)重排從而形成c系列硫肽。
最后，硫醇S-甲基化的SchX活性和醛還原的SchW活性被分別證實。將SchW或SchX加入反應混合物，約50%的2被消耗(Figure 4C)。在SchX的催化下，中間體4被S-甲基化為甲基巰基中間體7([M+ H]+m/z: 1711.5287，C74H91N18O20S5，Figure 4B)。在反應中加入羥胺得到衍生物8([M+H]+m/z: 1726.5388，C74H92N19O20S5，Figure 4B)證實了醛基的存在。同樣，在SchW的催化下，中間體4被還原為醇中間體9([M+H]+m/z: 1699.5278，C73H91N18O20S5)。
綜上所述，研究人員通過基因重組異源轉(zhuǎn)化和廣泛的體外生化實驗解析了c型硫肽抗生素形成的酶促過程。該過程開始于一系列b型硫鏈絲菌肽前體，通過一個F420依賴的哌啶合成酶催化脫氫哌啶還原得到a硫肽中間體。然后，細胞色素P450蛋白將鄰近的外環(huán)噻唑單元氧化，并通過環(huán)氧化、C-N鍵和C-S鍵裂解進行結(jié)構(gòu)重排與哌啶偶聯(lián)。最后，通過NADPH依賴的還原酶進行進一步醛還原和SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶參與的硫醇S-甲基化，形成c硫肽型咪唑哌啶雜環(huán)。本研究進一步加深了科研人員對硫肽抗生素生物合成的理解，例證了自然界如何從富含Cys和Ser/Thr的肽序列形成結(jié)構(gòu)復雜和多樣天然產(chǎn)物的過程，促進生物工程用于擴展分子多樣性和用途。本文通訊作者劉文研究員主要從事復雜天然產(chǎn)物的生物合成、以基因組掃描為手段新型天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)以及以產(chǎn)量提高和結(jié)構(gòu)多樣性為目的組合生物合成研究。文章信息：Botao Cheng, Heng Guo, Haoyang Wang, Qunfei Zhao, and Wen Liu*. Dissection of the Enzymatic Process for Forming a Central Imidazopiperidine Heterocycle in the Biosynthesis of a Series c Thiopeptide Antibiotic. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 13790?13797. https://doi.org/10.1021/jacs.1c05956
