今天分享的是ACS Catalysis上2019年6月Heather J. Kulik的文章: The Protein’s Role in Substrate Positioning and Reactivity for Biosynthetic Enzyme Complexes: The Case of SyrB2/SyrB1
單核非血紅素鐵(non-heme iron)酶由于可以選擇性官能團(tuán)化惰性碳?xì)滏I而吸引了廣泛注意，在醫(yī)療相關(guān)天然產(chǎn)物的生物合成路徑中是重要角色。非血紅素鐵酶的蛋白背景將鐵活性中心深埋，通過底物遞送部分控制專一性。SyrB2是這類酶中的一例，是Fe/α-ketoglutarate(αKG)-dependent halogenase (鐵/α-酮戊二酸依賴鹵化酶)，鐵(II)中心被兩個(gè)His、Cl和αKG配位。?；鶖y帶蛋白(Acyl carrier protein, ACP) SyrB1的prosthetic phosphopantetheine (PPant)臂將底物遞送并活化SyrB2，SyrB2氯化天然底物L(fēng)-Thr的C4。SyrB2類的鹵化酶與被深入研究的非血紅素鐵羥化酶在結(jié)構(gòu)和機(jī)理上相似。鹵化酶和羥化酶都通過Fe(IV)=O中間體實(shí)現(xiàn)氫攫取和隨后的鹵化或羥化。羥化酶中2His/1Asp(Glu)對羥化至關(guān)重要；鹵化酶中Asp被Ala或Gly置換促使Cl與金屬中心結(jié)合。
與Thr不同的非天然底物，如氨基丁酸(Aba)和norvaline(Nva)也可以被連接到SyrB1/PPant上，反應(yīng)活性上這些非天然底物被攫氫的速率快130倍，但羥化產(chǎn)物增加(圖1)。因此，SyrB2對天然底物鹵化時(shí)有一種“底物專一的低效”。
圖1 SyrB2/SyrB1復(fù)合物催化Thr, Aba和Nva氯化
理解SyrB2以及蛋白復(fù)合物對底物選擇性的影響是充滿挑戰(zhàn)的：SyrB2的晶體結(jié)構(gòu)中沒有明顯的底物遞送通道，SyrB1的晶體還未得到。計(jì)算模擬可以在未完成結(jié)構(gòu)解析時(shí)為蛋白間暫態(tài)相互作用提供洞見，然而目前SyrB2的計(jì)算模擬都是基于團(tuán)簇模型的。
Silakov和同事最近效仿前人對非血紅素鐵羥化酶的機(jī)理研究，通過HYSCORE(hyperfine sublevel correlation spectroscopy)估算了PPant所攜帶底物的甲基、亞甲基和羥亞甲基碳到蛋白催化中心鐵原子的距離。HYSCORE研究為分子模擬研究提出的SyrB2酶催化活性受底物定位的影響(Thr比非天然底物Aba和Nva到鐵中心距離遠(yuǎn))提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
SyrB2蛋白質(zhì)背景在賦予專一底物活性中的角色仍舊未知，本文中我們用長時(shí)間經(jīng)典分子動(dòng)力學(xué)(MD)和大尺度QM/MM研究蛋白-蛋白和蛋白-底物作用對反應(yīng)活性和選擇性的影響。模擬提供了Thr, Nva和Aba底物不同朝向的細(xì)節(jié)。這些數(shù)據(jù)揭示了SyrB2定位底物和影響反應(yīng)活性的蛋白-底物作用。本文對其他蛋白復(fù)合物活性位點(diǎn)作用研究也有幫助。
未形成復(fù)合物的自由SyrB1和SyrB2蛋白動(dòng)力學(xué)：
SyrB1屬于ACP蛋白家族，包含腺苷化(A)和巰基化(T)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，T結(jié)構(gòu)域通過PPant臂實(shí)現(xiàn)底物遞送，其中PPant臂通過磷酸化SyrB1的Ser與SyrB1蛋白相連，同時(shí)與底物Thr等形成硫酯來捕獲底物。雖然SyrB1還未得到晶體，但由于ACP T結(jié)構(gòu)域的保守性，作者通過同源模建獲取SyrB1結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在500ns分子模擬中保持穩(wěn)定。溶液中，PPant-S-Thr臂構(gòu)象空間十分寬闊。通過定義回轉(zhuǎn)半徑(Rg, gyration, 磷酸到Thr末端碳距離)，作者發(fā)現(xiàn)PPant臂構(gòu)象Rg在4埃位置有峰值，同時(shí)在3.5至7埃范圍內(nèi)均有構(gòu)象存在(圖2a,藍(lán)色)。在Rg最小的構(gòu)象中，PPant臂卷曲自己以縮小溶劑暴露表面積；Rg最大的構(gòu)象是舒展的、近乎直線的。此處的分子模擬揭示PPant經(jīng)常采取卷曲構(gòu)象，但也可以通過約1.5 kcal/mol的能壘舒展為自由能上稍高約0.5 kcal/mol的直線構(gòu)象，這一構(gòu)象可以伸展到SyrB2的活性空腔中。分子模擬的結(jié)果在類似PPant的核磁數(shù)據(jù)中得到了驗(yàn)證。
與自由的SyrB1不同，被對接到SyrB2的PPant臂只能采取相當(dāng)窄的構(gòu)象分布(圖2a,淺綠色)，其Rg大約為6.7埃，SyrB2中的PPant臂構(gòu)象與自由PPant的舒展構(gòu)象一致。
圖2 (a)攜帶Thr的PPant Rg的歸一化直方圖，分別衡量了自由的SyrB1(藍(lán)色)和SyrB2/SyrB1復(fù)合物(綠色)，并加入了代表性構(gòu)象。(b) 對接得到的SyrB2/SyrB1復(fù)合物，F(xiàn)196和活性位點(diǎn)是stick風(fēng)格。
SyrB2的晶體結(jié)構(gòu)中沒有明顯的底物遞送通道，但曾有假設(shè)指出苯丙氨酸殘基F196的旋轉(zhuǎn)可以引導(dǎo)底物遞送，但自由能上F196附近殘基是否允許這種轉(zhuǎn)動(dòng)仍然未知。這里作者通過長時(shí)間MD和傘取樣來定量底物遞送時(shí)蛋白的構(gòu)象變化。作者定義了F196的二面角ksi1和ksi2來研究其旋轉(zhuǎn)自由能面(圖3下左下角)。
圖3 (上) SyrB2中連接活性位點(diǎn)和溶劑環(huán)境的空腔，1左端紅色：閉合結(jié)構(gòu)能量最小點(diǎn)；2中間藍(lán)色：敞開結(jié)構(gòu)能量最小點(diǎn)；3右端綠色：SyrB2/SyrB1復(fù)合物結(jié)構(gòu)能量最小點(diǎn)。與Fe(II)配位的殘基是stick和sphere風(fēng)格，F(xiàn)196殘基門是stick風(fēng)格
(中) 閉合、敞開和復(fù)合物的空腔半徑分布?xì)w一化直方圖
(下) F196關(guān)于二面角 ksi1和ksi22的自由能面，白色點(diǎn)對應(yīng)晶體結(jié)構(gòu)，敞開結(jié)構(gòu)中的F196處于自由能面左側(cè)局域極小點(diǎn)
作者運(yùn)行了1.6μs的SyrB2晶體結(jié)構(gòu)以及九個(gè)F196旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的分子模擬，其中六個(gè)只在F196晶體構(gòu)象的附近運(yùn)動(dòng)(圖4)，其他四個(gè)則獲得了幾種不同F(xiàn)196旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，其相互轉(zhuǎn)化時(shí)間是數(shù)納秒。
圖4 以10個(gè)F196旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體為起點(diǎn)的分子模擬所采得的構(gòu)象，X處是起始構(gòu)象
隨后作者繪制了基于ksi1和ksi2的自由能面(圖3下)，晶體結(jié)構(gòu)恰好處于全局最小點(diǎn)，但另一局域最小點(diǎn)也很鮮明，兩最小點(diǎn)通過大約2.5 kcal/mol的自由能能壘相連。
作者通過空腔分析驗(yàn)證了另一局域最小點(diǎn)是否屬于SyrB2用于接收底物的敞開構(gòu)象，空腔分析發(fā)現(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)中F196附近的空腔半徑僅有1.2埃，局域最小點(diǎn)對應(yīng)空腔半徑為2.5埃，因此可以認(rèn)為納秒級的F196旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)了底物遞送。
SyrB1和SyrB2的界面相互作用和動(dòng)力學(xué)：
將SyrB1對接到SyrB2的敞開構(gòu)象得到的結(jié)構(gòu)在長時(shí)間分子模擬中保持穩(wěn)定，兩蛋白的質(zhì)心距離沒有明顯增加，經(jīng)典能量分解分析(如GBSA)發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵蛋白-蛋白作用用來穩(wěn)定復(fù)合物。有利作用主要是出現(xiàn)在SyrB1和SyrB2交界的柔性環(huán)區(qū)和小螺旋附近，比如SyrB1 D589和SyrB2 D58的鹽橋，這些作用將有助于通過突變實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)長壽命復(fù)合物。
PPant臂與SyrB2的有利作用也被揭示，如磷酸基與N184的氫鍵，與F195和F196的范德華作用。PPant羥基和E111的氫鍵作用占據(jù)了70%以上的MD快照。
圖5 PPant與周圍SyrB2殘基關(guān)鍵氫鍵、堆積和靜電作用的圖示
HYSCORE實(shí)驗(yàn)與蛋白-底物相互作用：
HYSCORE實(shí)驗(yàn)中使用與鐵催化中心結(jié)合的NO作為EPR探針，揭示了Thr相對與非天然底物與鐵的距離更遠(yuǎn)(Thr, 4.2±0.3埃；Nva, 3.4±0.3埃；Aba, 3.7±0.3埃)，底物與Fe-N鍵成銳角(Thr/Aba 85±10°，Nva 64±7°)，如圖6。
圖6 HYSCORE實(shí)驗(yàn)測得的底物和蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息
作者試圖通過分子模擬重現(xiàn)這些幾何信息，考慮到NO與鐵的配位有三種可能(圖7)，因此對于任一種底物都要模擬三種配位異構(gòu)體。然而基于經(jīng)典力場的分子動(dòng)力學(xué)未能重現(xiàn)圖6中的幾何參數(shù)，作者認(rèn)為是經(jīng)典分子力場不能得到包含短距離非共價(jià)作用的構(gòu)象，因此作者基于HYSCORE實(shí)驗(yàn)參數(shù)運(yùn)行Restrained MD，來獲得蛋白與底物的關(guān)鍵相互作用。
圖7 NO作為探針與鐵催化中心結(jié)合后可能的配位異構(gòu)體
加入限制力后的分子模擬結(jié)果中沒有出現(xiàn)明顯的異常鍵長鍵角，在三種NO配位異構(gòu)體中都重現(xiàn)了HYSCORE實(shí)驗(yàn)觀察到的鍵長鍵角趨勢(圖8)。作者觀察到Restrained MD中帶電殘基對整體作用的貢獻(xiàn)與中性殘基與底物作用相當(dāng)，然而未加限制力的MD中帶電殘基與底物的作用在蛋白-底物作用中占主導(dǎo)，作者認(rèn)為這是經(jīng)典分子力場的點(diǎn)電荷模型導(dǎo)致的計(jì)算假象。隨后作者通過化學(xué)經(jīng)驗(yàn)排除了eq和ax-αKG兩種異構(gòu)體，專注于與晶體結(jié)構(gòu)更加相似的ax異構(gòu)體的分析。
圖8 上 在三種NO配位異構(gòu)體中HYSCORE測量的鍵長(Fe-Me/Mt)和鍵角(Fe-N-Me)
下 實(shí)驗(yàn)測得的鍵長鍵角以及誤差由橢圓形區(qū)域表示，Restrained MD計(jì)算得到的鍵長鍵角由圓圈、方框和三角及其穿過的線段分別表示均值和誤差
作者發(fā)現(xiàn)Fe-Me和Fe-Mt鍵長與底物進(jìn)入酶活性空腔的深度有關(guān)(圖9)，天然底物Thr相對于Nva和Aba進(jìn)入空腔的深度更大，因此其Fe-Me和Fe-Mt鍵長更長。
更長
圖9 Thr, Nva和Aba在底物遞送時(shí)進(jìn)入SyrB2的深度，作者觀察SyrB2蛋白結(jié)構(gòu)選定了兩個(gè)相對靜止的殘基B11和B12，通過測量底物甲基C和氨基N到B11和B12的距離差來衡量底物進(jìn)入SyrB2空腔的深度，數(shù)值越小表示越深。
曾有假設(shè)認(rèn)為底物和位點(diǎn)專一的羥基化/鹵化產(chǎn)物比例由底物定位決定，即與Fe(IV)=O中間體距離次優(yōu)的構(gòu)象導(dǎo)致氯化而不是羥基化。由于HYSCORE實(shí)驗(yàn)中NO占據(jù)了鐵配體OH的位置，Restrained MD給出的C-N距離可以認(rèn)為是被活化C到OH距離，圖10展示了三種底物中C-N和C-Cl距離的分布，其中Nva的C4也可能被官能化，可以看出C-N距離Nva遠(yuǎn)小于Aba和Thr，但三者C-Cl距離幾乎相同。Nva C4的官能團(tuán)化速率以及羥基化/氯化產(chǎn)物分布與Aba結(jié)果相似，從圖中Aba和Nva C4灰色輪廓線的大致重合可以推知這一點(diǎn)?？傊髡哒J(rèn)為天然底物Thr“底物專一的低效”源于Thr相對于Nva和Aba距高價(jià)鐵氧中間體的距離遠(yuǎn)，而不是與Cl距離近。
圖10 左：ax異構(gòu)體中C-N和C-Cl距離的分布，其中灰色輪廓線代表Nva的C4
右：三種底物的代表性構(gòu)象
蛋白-底物的氫鍵：
雖然作者用Restrained MD重現(xiàn)了HYSCORE觀測的幾何參數(shù)，但作者仍打算在QM/MM水平探索催化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。最后作者發(fā)現(xiàn)50個(gè)QM/MM結(jié)構(gòu)優(yōu)化構(gòu)象與HYSCORE幾何參數(shù)接近。
隨后作者用BCP(Bond critical point)分析了蛋白-底物的氫鍵，Thr與N123形成兩個(gè)強(qiáng)度分別為-7.2 kcal/mol和 -5.2 kcal/mol的氫鍵(圖11)；Aba只與N123形成一個(gè)強(qiáng)度為-6.9 kcal/mol的氫鍵，由于Aba缺乏另一個(gè)氫鍵的束縛，其甲基傾向于靠近鐵中心；Nva與Aba情況類似，只形成一個(gè)氫鍵。
圖11 Thr(a)和Aba(b)與N123形成的氫鍵的BCP點(diǎn)及其強(qiáng)度
QM/MM優(yōu)化Thr與N123的單一氫鍵結(jié)合結(jié)構(gòu)不能得到雙氫鍵構(gòu)象，說明單/雙氫鍵的構(gòu)象轉(zhuǎn)化間存在能壘。隨后作者通過經(jīng)典分子力場的構(gòu)象采樣發(fā)現(xiàn)分子力場水平也存在雙氫鍵構(gòu)象，但由于精確度有限，分子力場下的雙氫鍵構(gòu)象比單一氫鍵構(gòu)象能量稍高(圖12)。
圖12 經(jīng)典分子動(dòng)力學(xué)采樣得到的氫鍵結(jié)合能量變化
接下來作者用只含活性空腔殘基的團(tuán)簇模型量化優(yōu)化了底物與關(guān)鍵殘基的氫鍵，Nva和Aba在關(guān)鍵殘基不固定時(shí)可形成多個(gè)強(qiáng)氫鍵，然而根據(jù)蛋白骨架位置固定關(guān)鍵殘基后，量化優(yōu)化的團(tuán)簇模型只給出單氫鍵構(gòu)象，說明蛋白骨架在非天然底物定位中對氫鍵數(shù)量有顯著影響。
作者總結(jié)到：蛋白背景為天然底物Thr提供雙氫鍵，穩(wěn)定化能超過21kcal/mol；然而非天然底物只有一個(gè)氫鍵，穩(wěn)定化能約15 kcal/mol。雙氫鍵作用固定底物，使其遠(yuǎn)離鐵中心(圖13)。
圖13 單/雙氫鍵模型對底物定位的影響
基于上述討論，作者期待N123的突變可以顯著影響天然底物的氯化效率，回顧文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)突變體N123A/N123Q使活性降低到26-30%。另外作者認(rèn)為另一種有晶體結(jié)構(gòu)的鹵化酶WeIO5也可以通過本文的流程分析其底物-蛋白作用。
總結(jié)：
作者確認(rèn)了F196旋轉(zhuǎn)打開底物遞送通道，SyrB1和SyrB2接觸面殘基重新排布進(jìn)一步打開通道；盡管自由的SyrB1 PPant臂采取卷曲構(gòu)象，但可以為底物遞送異構(gòu)化為直線構(gòu)象，SyrB1/SyrB2復(fù)合物中PPant臂直線構(gòu)象的運(yùn)動(dòng)被關(guān)鍵殘基間的作用限制。
SyrB1/SyrB2復(fù)合物的無限制力經(jīng)典動(dòng)力學(xué)沒有重現(xiàn)HYSCORE給出的幾何信息，施加限制力后得到了預(yù)期結(jié)果。從Restrained MD結(jié)果中作者發(fā)現(xiàn)了天然底物Thr與N123形成兩個(gè)氫鍵，而非天然底物只有一個(gè)氫鍵，使非天然底物的運(yùn)動(dòng)受限程度降低，從而親近了鐵中心。相對于Nva和Aba，Thr被SyrB1遞送到SyrB2更深處。三種底物的C-Cl距離相似，Thr C-O距離比Nva和Aba長。
不僅僅局限于SyrB1/SyrB2，作者認(rèn)為他們開發(fā)的Protocol可以擴(kuò)展到其他ACP遞送底物的過程，譜學(xué)指導(dǎo)的MD也不失為一種準(zhǔn)確刻畫蛋白-底物和蛋白間相互作用的方法。
