今天為大家分享一篇發(fā)表在Cell Chemical Biology上的文章，文章的題目是“Chemoproteomics profiling of surfactin-producing nonribosomal peptide synthetases in living bacterial cells”。其通訊作者是來自近畿大學(xué)藥學(xué)院的Genzoh Tanabe教授和Fumihiro Ishikawa教授，他們的實(shí)驗(yàn)室主要研究藥物化學(xué)。本文中，作者對(duì)非核糖體肽合成酶NRPS進(jìn)行了研究。
非核糖體肽合成酶NRPS是一大類產(chǎn)生天然肽及其衍生物的酶，具有豐富的結(jié)構(gòu)和功能。NRPS的廣為人知的底物包括萬古霉素、抗腫瘤藥物博來霉素和免疫抑制劑環(huán)孢霉素等。經(jīng)典的NRPS模塊由3種酶組成：腺苷化（A）、巰基化（T）和縮合（C）domain，A domain首先催化氨基酸形成氨基-AMP中間體，T domain隨后親核進(jìn)攻該中間體得到氨基-S-T中間體，并最終通過C domain催化兩個(gè)氨基-S-T中間體形成肽鍵。當(dāng)前，關(guān)于NRPS的研究往往局限于基于異源表達(dá)的體外研究策略。而對(duì)內(nèi)源NRPS的研究才剛剛起步，以融合表達(dá)熒光蛋白標(biāo)簽和過表達(dá)體系+單克隆抗體等方法為主。這些方法不僅需要進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，破壞了天然的生理?xiàng)l件，同時(shí)也無法直接檢測(cè)內(nèi)源NRPS的活性，因此開發(fā)一種直接、內(nèi)源的NRPS研究方法非常關(guān)鍵?；诨钚缘牡鞍踪|(zhì)分析ABPP是一種非常適合在天然條件下研究?jī)?nèi)源蛋白的工具，通過使用基于活性的共價(jià)探針對(duì)目的蛋白進(jìn)行標(biāo)記即可開展一系列的下游研究。
作者首先進(jìn)行了化學(xué)探針的設(shè)計(jì)工作。作者首先選擇了枯草桿菌ATCC 21332進(jìn)行分析，其合成表面活性素surfactin的過程是由3種NRPS酶復(fù)合物共同完成的。其中SrfAB-NRPS中的一個(gè)A domain對(duì)Asp具有高度保守的底物選擇性。因此作者合成了L-Asp-AMS-BPyne探針對(duì)其這個(gè)Asp激活的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)作者在探針上組裝了二苯甲酮和炔基用于光交聯(lián)和后續(xù)富集等實(shí)驗(yàn)。接著作者在裂解物中進(jìn)行了體外標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。他們直接將探針加入到細(xì)菌蛋白質(zhì)組中，并使用UV處理、熒光標(biāo)記，并平行地用不帶光交聯(lián)和炔基基團(tuán)的Asp-AMS競(jìng)爭(zhēng)。結(jié)果顯示，該探針對(duì)SrfAB-NRPS具有非常高的選擇性。隨后作者直接在活細(xì)菌上進(jìn)行探針的內(nèi)源標(biāo)記，結(jié)果顯示，其能夠穿透細(xì)胞，并以高選擇性的方式標(biāo)記SrfAB-NRPS，背景也控制的很好。在驗(yàn)證了探針的可行性后，作者接下來使用這一探針進(jìn)行了活細(xì)胞內(nèi)NRPS活性的研究。在測(cè)試了探針在活細(xì)胞內(nèi)熒光成像的能力之后，他們將收集的菌體用PBS重懸，并加入探針進(jìn)行為期1 h的標(biāo)記。隨后的活細(xì)胞水平的CuAAC反應(yīng)結(jié)果顯示，熒光信號(hào)擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。這與之前關(guān)于NRPS的亞細(xì)胞定位研究是符合的。最后，作者研究了SrfAB-NRPS在活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。在對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的菌體進(jìn)行探針標(biāo)記后，他們驚訝地發(fā)現(xiàn)，在SrfAB-NRPS下方出現(xiàn)了一個(gè)新的條帶。他們猜測(cè)，這一條帶可能對(duì)應(yīng)的是SrfAB-NRPS的降解產(chǎn)物。為了驗(yàn)證這一猜想，作者合成了一系列氨基酸-AMS來進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ABPP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果只有Asn和Asp產(chǎn)生了明顯的競(jìng)爭(zhēng)信號(hào)，且競(jìng)爭(zhēng)模式與SrfAB-NRPS抑制，說明該截?cái)囿w的確來自SrfAB-NRPS，且包含了具有Asp選擇性的A domain。為了進(jìn)一步確定該截?cái)囿w，他們采用了切膠酶切策略。根據(jù)LC-MS/MS的序列覆蓋度，他們證明這一截?cái)囿w確實(shí)部分來自于SrfAB-NRPS C端的E和T domain，由此揭示了一種新的SrfAB-NRPS降解過程。
綜上所述，在本文中作者開發(fā)了一種高選擇性靶向非核糖體肽合成酶SrfAB-NRPS中Asp選擇性結(jié)構(gòu)域的化學(xué)探針，實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)SrfAB-NRPS的熒光標(biāo)記，并通過切膠質(zhì)譜的方法揭示了一種新的SrfAB-NRPS降解過程。https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2451945621002592原文引用：DOI：10.1016/j.chembiol.2021.05.014
