今天分享的是本月JACS上ASAP的文章，作者是意大利比薩大學的Benedetta Mennucci教授。
DOI：10.1021/jacs.0c10461
本文圖片(除圖1)來自J. Am. Chem. Soc.
細菌是地球上可進行光合作用的最古老的生物類型，對細菌光合作用的研究可以幫助人們更好地理解光合作用的產(chǎn)生和演化。多數(shù)光合作用細菌是不產(chǎn)氧的，但藍細菌(cyanobacteria)的光合作用使用水作為電子供體并釋放氧氣，與植物光合作用相似。藍細菌進化出了一種光保護系統(tǒng)，在光線強度超過光合作用可接納的強度時，能防止過量光線對組織的破壞。光保護與光捕獲相互競爭：前者通過非光化學淬滅(nonphotochemical quenching, NPQ)使過量光能迅速消散為熱能；后者在生物膜上引入其他蛋白，擴大有效受光面積，捕捉更多光子并傳遞給光合作用反應中心，從而提高光合作用效率，如圖1。與植物和藻類不同，藍細菌的光保護和光捕獲是同一套系統(tǒng)完成的。這套系統(tǒng)中的水溶性蛋白“橙色類胡蘿卜素蛋白”(Orange Carotenoid Protein, OCP)引導了能量消散過程，作者對這個關鍵蛋白做了分子動力學模擬。
圖1 光合作用膜反應復合物示意圖，LH1和LH2是光捕獲蛋白1和2，灰綠色方片是細菌葉綠素。圖片來自Carl Branden, John Tooze. Introduction to protein structure (1999, Garland Science)
OCP包含兩個結構域，分別是N-端和C-端結構域，如圖2，簡記為NTD(黃色)和CTD(藍色)。NTD和CTD的末端分別是NTE(洋紅)和CTT(綠色)，兩結構域由linker相連(銀色)。除NTD和CTD之間的主接觸面外，NTE和CTT也形成了次接觸面。OCP有兩種可轉化的構象，橙色的OCP_O和紅色的OCP_R。OCP_O中，類胡蘿卜素分子結合在橫跨NTD和CTD的口袋，通過兩個氫鍵與CTD緊密相連。NPQ過程中，閉合的橙色OCP_O吸收強藍光，轉化為OCP_R并具備活性。同時，類胡蘿卜素移位到NTD一側，NTD與CTD解離，如圖3。紅色的OCP_R引發(fā)后續(xù)NPQ過程。
圖2 OCP與類胡蘿卜素復合物的晶體結構，W_288和Y_201與類胡蘿卜素形成氫鍵。
圖3 OCP_O經(jīng)歷類胡蘿卜素移位和結構域解離轉化為OCP_R。
作者用原子級分子模擬詳細揭示了OCP異構過程。光激發(fā)過程需要量子力學的動力學描述，但當前的計算能力只能處理極短的過程。另外類胡蘿卜素移位的時間尺度為納秒至微秒級，兩結構域解離為微秒級事件。為克服較大的時間尺度，作者使用傘取樣(umbrella sampling, US)與REMD(replica exchange MD)相結合的增強采樣方案。
作者定義類胡蘿卜素和NTD的質心間距離為反應坐標(collective variable, CV)，US-REMD所得能量輪廓如圖4。由于類胡蘿卜素分子最終抵達NTD結構域，因此CV最大值處(右側)是反應起點。通過分析RMSD，作者斷定CV=11.5埃處全局最小點結構為OCP_O，如圖5。由右向左，經(jīng)歷較小能壘抵達局域最小點T1，CV=7.5埃。T1中的類胡蘿卜素稍稍離開結合口袋，兩個氫鍵已經(jīng)打斷。除此之外，T1大體保持OCP_O的構象。T1向左翻越最高能壘后抵達T2，T2中的類胡蘿卜素已經(jīng)離開T1，如圖5。
圖4 沿反應坐標的自由能面(由右向左)。
圖5 (上) CV=11.5埃處結構(藍色)與OCP_O(橙色)重疊圖像；(下) CV=2.5埃處結構(T2，藍色)與相關蛋白RCP晶體結構的重疊圖像， 說明類胡蘿卜素在T2中的位置是合理的。
圖6 (上) T1(藍色)與OCP_O(橙色)的重疊圖像；(下) T2(紅色)與OCP_O(橙色)的重疊圖像。
隨后，作者分析了類胡蘿卜素移位的驅動力，繪制類胡蘿卜素與蛋白的作用能、與水的作用能和分子內能相對于反應坐標(由右向左)的圖像，如圖7。自移位伊始，類胡蘿卜素與水的有利作用強有力地抵消了移位過程中與蛋白的排斥。此處，類胡蘿卜素丟失了與CTD的兩個氫鍵造成了與蛋白的排斥，如圖6。溶劑水是穩(wěn)定T1和T2的主角，雖然類胡蘿卜素在OCP_O中與W_288和Y_201形成的氫鍵是溶劑不可及的，但隨著體系向T1運動，類胡蘿卜素的溶劑可及表面逐步擴大。另外前人假設，光激發(fā)后扭曲的類胡蘿卜素分子像彈簧一樣推動OCP_O向OCP_R轉變，但類胡蘿卜素分子的內能在OCP_O至T1區(qū)間(圖7)是增長的，與前人猜想相左。
圖7 沿反應坐標，類胡蘿卜素與蛋白和水的作用能(上)及其能量分解(下)。
接下來，相互作用力被分解為色散和靜電貢獻兩部分，分別對應LJ(Lennard-Jones)勢和靜電勢，如圖7。與直覺相悖，OPC_O中類胡蘿卜素與NTD結合力更強，類胡蘿卜素開始移位并逃出CTD雙氫鍵成鍵范圍后，與CTD結合力持續(xù)減弱，與NTD結合力持續(xù)增強。進一步分解作用力到各個殘基后，作者發(fā)現(xiàn)移位開始后，NTD的多個殘基都增強了與類胡蘿卜素的LJ作用。這說明移位過程似乎不是由某些特定殘基驅動的，而是受整體結合面的影響，特別是圍繞結合口袋的非極性或芳香性殘基與類胡蘿卜素的LJ作用持續(xù)增加。
受內能變化的啟發(fā)，作者分析了類胡蘿卜素分子末端環(huán)狀取代基在分子移位時的構象變化。作者定義二面角β1和β2來表征構象(Mio看完全文沒有確定到底是哪兩個二面角，畢竟這不是Mio的本行啦)，繪制β1和β2關于反應坐標的勢能面，如圖8。由于作者采用的力場經(jīng)歷了DFT計算修正，所以能夠在納秒尺度上描述類胡蘿卜素環(huán)狀取代基的旋轉。對于β1，這個二面角在T2前被鎖定在s-trans構象；β2與β1類似，但T1中環(huán)狀取代基已經(jīng)運動到口袋外，自由度增大，所以能在兩s-cis構象間轉化。T2時，末端兩環(huán)自由度顯著增大，正如圖9中環(huán)取代基的混亂構象。
圖8 類胡蘿卜素末端環(huán)狀取代二面角β2和β1沿著反應坐標的變化。
圖9 兩個環(huán)狀取代基構象的重疊圖像。
完成類胡蘿卜素分子構象分析后，作者轉而探究NTD和CTD解離的問題。一般認為，結構域解離是OCP光活化過程中的最慢步驟，由于解離后兩結構域自由度增加，被認為伴隨著顯著熵效應，能抵消結構域間接觸面消失所損失的結合能。因此，作者使用了well-tempered metadynamics (wt-MetaD)來高效探索解離過程。wt-MetaD的反應坐標選定為結構域間特定接觸圖(contact map, CM, 如下式)的存在和消失，解離前CM=0，解離完成CM=1，計算時同時向回轉半徑Rg和CM加偏(bias)勢。
為作對比，作者運行了從OCP_O和T2處結構出發(fā)的wt-MetaD，結果如圖10。定性地看，從OCP_O出發(fā)的分子不解離，構象被束縛在最小點附近；T2出發(fā)的分子非常迅速地解離，先抵達接觸面消失的過渡區(qū)域(CM=1)，再逐步增大回轉半徑抵達終點。作者認為OCP_O和T2處wt-MetaD的不同結果并不奇怪，OCP_O狀態(tài)中類胡蘿卜素與NTD和CTD的結合能大約都在40 kcal/mol，類胡蘿卜素移位后，與CTD的結合能下降到10 kcal/mol，使NTD和CTD的解離變得容易。另外，熱力學上講，兩結構域接觸面消失的能量損失可被溶劑化能補償。作者又補充了從不含類胡蘿卜素的OCP_O出發(fā)的wt-MetaD，與T2一樣，此時兩結構域能夠解離。以上結果說明類胡蘿卜素對OCP_O閉合構象的穩(wěn)定非常重要，光激發(fā)后改變的類胡蘿卜素-蛋白間作用模式促使了結構域解離。
圖10 OCP_O和T2出發(fā)的wt-MetaD得到的構象向CM和Rg投影后的分布。
作者還分析了NTD和CTD結構域的穩(wěn)定性，RMSD圖如圖11。NTD和CTD的RMSD均小于2埃，說明這兩個結構域在解離過程中相當穩(wěn)定。但是，對于NTE和CTT，RMSD變化明顯，重疊多幀NTE和CTT的構象發(fā)現(xiàn)，解離過程中二者的朝向不固定，表現(xiàn)出無序卷曲狀，這說明二者形成的次接觸面對穩(wěn)定二者的構象非常關鍵。
圖11 NTE, NTD, CTD和CTT的RMSD。
最后，作者發(fā)現(xiàn)解離過程中類胡蘿卜素在NTD中位置幾乎不變，保持T2的狀態(tài)，說明類胡蘿卜素移位發(fā)生在結構域解離之前。另外，linker部分形成了新的α螺旋(圖12)，在模擬中相當穩(wěn)定，說明即使是蛋白中的低保守區(qū)，也有潛在的生物功能。
圖12 完全解離的OCP。
總結：
作者用全原子分子模擬研究了OCP光活化后的反應歷程，發(fā)現(xiàn)：只有類胡蘿卜素移位后兩結構域才能解離，解離后蛋白的二三級結構幾乎不變。沿著反應坐標先后出現(xiàn)的中間體T1和T2與光譜發(fā)現(xiàn)的中間相對應。OCP_O中類胡蘿卜素鎖定兩結構域，使其相對穩(wěn)定；光激發(fā)后，類胡蘿卜素像”門栓“一樣移位到NTD，打破兩結構域間相互作用的平衡，使其解離。這一歷程與前人提出的“彈簧”模型不同。
