微生物II型聚酮化合物是小分子化學(xué)藥物的重要部分，如抗腫瘤藥物四環(huán)素、阿霉素等均屬于II型聚酮類化合物。從生物合成角度分析，II型聚酮化合物主要是由II型聚酮合酶、酮基還原酶、環(huán)化酶或芳香化酶催化形成線性或角型的多酚環(huán)聚酮骨架，隨后氧化還原后修飾酶可以催化聚酮骨架中間體氧化重排形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、活性良好的II型聚酮天然產(chǎn)物。因此，在基因和蛋白水平上對這些分子內(nèi)的碳骨架重排過程進(jìn)行研究，對發(fā)現(xiàn)新穎的酶催化機(jī)制、探究其構(gòu)效關(guān)系具有重要意義。
Chartreusin是一強(qiáng)效抗腫瘤芳香聚酮化合物，早期13C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明其獨(dú)特的五環(huán)芳烴雙內(nèi)酯結(jié)構(gòu)是經(jīng)過非同尋常的碳骨架氧化重排而來。在先前的研究中，我們揭示了雙加氧酶ChaP催化鄰苯醌底物3通過氧化脫羧的方式形成chartarin （2）的分子機(jī)制（J. Am. Chem. Soc. 2018,140, 10909）。按照推測由resomycin C（4）到鄰苯醌產(chǎn)物（3）的生物合成過程中，聚酮骨架發(fā)生了顯而易見的重排，但如何重排至今未解。
目前，我們進(jìn)一步研究揭示了由四環(huán)resomycin C（4）到五環(huán)的鄰苯醌產(chǎn)物（3）僅需兩個(gè)酶ChaZ和ChaE即可完成這一復(fù)雜的氧化重排過程。
早在2005年，德國Christian Hertweck教授實(shí)驗(yàn)室，鑒定了chartreusin的生物合成基因簇，并初步推測了其合成途徑，他們從chaZ的基因敲除突變株中分離得到resomycin C，但由于化學(xué)回補(bǔ)的失敗并未證實(shí)resomycin C是否是chartreusin的生物合成的中間體?；诖耍覀兪紫惹贸S素依賴單加氧酶的編碼基因chaZ，并累積到線性四環(huán)產(chǎn)物resomycin C（4），我們發(fā)現(xiàn)4的溶解度很低，通過加入吐溫-80有效地提高了溶解度，并成功實(shí)現(xiàn)了化學(xué)回補(bǔ)，證明resomycin C是chartreusin生物合成的關(guān)鍵中間體（圖1B）。進(jìn)一步，經(jīng)體外酶學(xué)生化表征，證明了ChaZ可對resomycin C進(jìn)行Baeyer-Villiger氧化形成插氧化合物，但由于自身的不穩(wěn)定性，可快速自發(fā)水解形成開環(huán)化合物5。
圖1. A）Chartreusin的生物合成路線推測；B）野生型及突變株代謝產(chǎn)物HPLC分析；C）Resomycin C在釀酒酵母RC01中的生物轉(zhuǎn)化。
進(jìn)一步，通過與蒽環(huán)霉素類化合物aklavinone和nogalamycin的生物合成基因簇進(jìn)行比對，我們定位到三個(gè)酮基還原酶ChaD、ChaE和ChaL可能參與到chartreusin的氧化重排后修飾過程中（圖2D）。通過生物信息學(xué)分析、基因敲除、異源表達(dá)等揭示了chaE是參與chartreusin氧化重排的關(guān)鍵基因（圖1）。通過體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ChaE在輔因子NADPH的作用下，催化化合物6的還原，生成五環(huán)化合物3（圖2E）。
圖2. ChaZ和ChaE的功能表征
進(jìn)一步，通過密度泛函理論計(jì)算對ChaE催化機(jī)理進(jìn)行推測。首先在II型PKSs作用下遵循經(jīng)典的蒽環(huán)霉素生物合成途徑生成線性四環(huán)中間體4，由于受到C11位羥基影響，C13內(nèi)酯羰基更容易被ChaE還原形成半縮醛的形式IM1，自發(fā)開環(huán)形成末端醛基IM2，環(huán)系翻轉(zhuǎn)后自發(fā)縮合形成新的C-C鍵，隨后自發(fā)的內(nèi)酯化、氧化及芳構(gòu)化形成五環(huán)的鄰苯醌產(chǎn)物3。DFT計(jì)算表明，一旦半縮醛形成之后，后續(xù)的反應(yīng)可以自發(fā)快速的進(jìn)行（圖3）。
圖3. DFT計(jì)算ChaE催化過程中所需的吉布斯自由能
至此，我們解析了chartreusin完整的氧化重排過程，發(fā)現(xiàn)在chartreusin生物合成過程中通過一線性四環(huán)化合物到角型五環(huán)化合物的重排過程非常簡潔，僅需兩個(gè)酶就可實(shí)現(xiàn)。ChaZ催化一Bayer-Villager類型的插氧反應(yīng)，緊接著ChaE催化一酯基的還原反應(yīng)并伴隨著一系列的自發(fā)反應(yīng)形成五環(huán)化合物，這是目前已知的首個(gè)可催化酯基還原的酮基還原酶，該研究揭示了這一抗腫瘤分子chartreusin最后遺留的生物合成謎團(tuán)。
南京大學(xué)博士研究生焦方文和已畢業(yè)博士研究生王以爽為文章的共同第一作者，戈惠明、焦瑞華、譚仁祥和梁勇教授為文章的共同通訊作者。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家杰出青年基金、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)等項(xiàng)目的資助。
