體外多酶催化，是近年來合成生物學(xué)新興的一種生物合成技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于材料、醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。然而，體外多酶催化經(jīng)常需要輔因子（如ATP和NADPH）參與，而天然輔因子的穩(wěn)定性、成本、以及與多酶間的適配性，會制約整個催化系統(tǒng)的性能。傳統(tǒng)的解決方法主要是構(gòu)建基于酶催化的輔因子再生模塊，但該方法需要引入新的酶和共底物，或者利用體系自身的底物提供輔因子再生的能量，會降低催化系統(tǒng)的原子經(jīng)濟(jì)性。通過電催化、光催化或人工脂質(zhì)體的方法可以分別再生NADPH或ATP，卻無法實現(xiàn)NADPH和ATP的共再生，對于一些同時需要這兩種輔因子的系統(tǒng)就無法使用。
天然類囊體膜，作為天然的能量轉(zhuǎn)化模塊，具有光能轉(zhuǎn)化效率高、ATP和NADPH共再生能力強(qiáng)、電子傳遞效率高等優(yōu)點，是非常理想的可用以解決體外多酶催化系統(tǒng)中NADPH和ATP能量供應(yīng)及共再生問題的“綠色引擎”。近日，中科院天津工業(yè)生物所朱之光研究員團(tuán)隊以乙酸鈉到聚3-羥基丁酸酯(PHB)的體外合成為例，基于植物類囊體膜天然且高效的光合作用機(jī)制，引入來自菠菜的類囊體膜，通過光能驅(qū)動類囊體膜同時空共再生NADPH和ATP，并耦聯(lián)一條五酶級聯(lián)催化產(chǎn)PHB的途徑，成功構(gòu)建了一個光能利用與物質(zhì)轉(zhuǎn)化高效協(xié)同的體外多酶催化系統(tǒng)（圖1）。
圖1. 利用天然類囊體膜驅(qū)動體外多酶催化乙酸鈉合成PHB 在設(shè)計上，為了能夠與天然類囊體膜進(jìn)行輔因子/能量耦合利用，作者挖掘了NADPH-依耐型PhaB和ATP-依耐型ACS，并引入PAP酶，實現(xiàn)整個系統(tǒng)的NADPH和ATP再生循環(huán)利用。該研究工作中，由于植物類囊體膜是一個相對獨(dú)立且復(fù)雜的光反應(yīng)系統(tǒng)，因此，作者單獨(dú)對其進(jìn)行了光反應(yīng)活性優(yōu)化（圖2）。通過優(yōu)化后，反應(yīng)動力學(xué)證明，在50 μmol photon m-2 s-1光照下，同時添加5 μM外源Fdx，可獲得最佳NADPH和ATP光再生速率。 圖2. 天然類囊體膜光化學(xué)反應(yīng)優(yōu)化 接下來，作者將PHB合成系統(tǒng)與優(yōu)化后的類囊體膜系統(tǒng)進(jìn)行體外耦聯(lián)，獲得基于乙酸鈉的PHB碳摩爾轉(zhuǎn)化效率為56%。為了進(jìn)一步提高此效率，作者通過對整個系統(tǒng)的熱力學(xué)和反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行分析后主要從兩方面來解決這個問題：1.組分優(yōu)化并進(jìn)行系統(tǒng)適配；2.提高類囊體膜光反應(yīng)活性的穩(wěn)定性。作者通過采用固定底物濃度，控制單一變量進(jìn)行逐步優(yōu)化的方法，通過重點優(yōu)化反應(yīng)體系中的類囊體膜添加量、輔因子（NADP+和 AMP）濃度、CoA 濃度、酶添加比例等條件，實現(xiàn)類囊體膜與 PHB 合成體系的高效適配。同時，作者在研究過程中還發(fā)現(xiàn)，添加甜菜堿后，可以大大增加類囊體膜的光反應(yīng)活性穩(wěn)定性，但是超過0.5 M會明顯降低PHB的產(chǎn)量。 通過優(yōu)化后的光驅(qū)動PHB體外合成系統(tǒng)，當(dāng)以10 mM乙酸鈉為底物時，碳摩爾轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了86%，光能轉(zhuǎn)化率達(dá)到了3.27%（圖3A），而當(dāng)整個體系組分同時擴(kuò)大5倍后，以 50 mM乙酸鈉為原料能夠合成20 mM PHB，碳摩爾轉(zhuǎn)化率還能達(dá)80.0%，光能轉(zhuǎn)化效率達(dá)3.04% （圖3B）。該光能轉(zhuǎn)化效率已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然界植物的光能轉(zhuǎn)化效率（~1%），這說明，將類囊體膜作為驅(qū)動酶級聯(lián)反應(yīng)的綠色引擎的策略，將為體外生物制造提供一個非常有前景的選擇。 圖3. 優(yōu)化條件下不同時間點地PHB產(chǎn)生和乙酸鈉消耗 該研究工作提出的將天然類囊體膜作為綠色能量驅(qū)動引擎驅(qū)動體外多酶催化途徑，既實現(xiàn)了光能利用與物質(zhì)轉(zhuǎn)換的良好時空耦合，為PHB的合成提供了一條可行的合成策略，也為更多體外合成生物系統(tǒng)的構(gòu)建提供了新思路。 論文信息： Installing a Green Engine to Drive an Enzyme Cascade: a Light-Powered in vitro Biosystem for Poly(3-hydroxybutyrate) Synthesis Fei Li,Xinlei Wei,Lin Zhang,Cheng Liu,Chun You,Zhiguang Zhu 天津工業(yè)生物所博士后李飛為論文第一作者，朱之光研究員為論文通訊作者。該研究獲得了天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動和特別博士后項目的資助支持。 Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202111054
