分享一篇發(fā)表在Journal of Biological Chemistry上的文章：Identification of small molecule allosteric modulatorsthat act as enhancers/disrupters of rhodopsin oligomerization。本文的通訊作者有兩位，其中一位是來自猶他大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系的助理教授Frans Vinberg，他主要研究視黃醛的病理和生理學(xué)問題以及感光細(xì)胞中的鈣信號調(diào)控。另一位Krzysztof Palczewski教授來自UC Irvine，主要研究視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞中視紫紅質(zhì)感光機(jī)制和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。本文中，作者對50000個小分子進(jìn)行高通量篩選（HTS），并發(fā)展了新的實(shí)驗(yàn)方法檢測視紫紅質(zhì)的二聚現(xiàn)象，最后發(fā)現(xiàn)了9種可以通過別構(gòu)調(diào)節(jié)促進(jìn)/抑制視紫紅質(zhì)二聚的小分子。
視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)在視覺產(chǎn)生中發(fā)揮了重要作用，與大多數(shù)GPCR類似，視紫紅質(zhì)也有發(fā)生多聚的傾向。GPCR多聚效應(yīng)被廣泛認(rèn)為對其結(jié)構(gòu)、功能和藥理學(xué)性質(zhì)存在影響，以高時空分辨率精確調(diào)控著下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，然而，視紫紅質(zhì)多聚的生物效應(yīng)尚未研究明確。一些可以影響GPCR多聚的化學(xué)小分子或許可以幫助我們認(rèn)識這些多聚體的生物學(xué)和化學(xué)性質(zhì)。本文中，作者在異質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中對小分子進(jìn)行高通量篩選，接下來在原始的視蛋白上表征HTS得到的分子的生物化學(xué)和電生理性質(zhì)，最后進(jìn)行一系列藥物實(shí)驗(yàn)。首先，作者獲取了包含50000個小分子的ON L0S1J0庫，通過HTS在U2OS視蛋白/β-gal亞基（acceptor-EA與donor-PK二者之一）融合蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)系上篩選庫中靶向視紫紅質(zhì)二聚的小分子。當(dāng)視紫紅質(zhì)發(fā)生自締合時，互補(bǔ)的β-gal亞基結(jié)合，在β-gal底物存在時報告化學(xué)熒光信號。同時，作者還利用Venus和RLuc設(shè)計了與之平行的另一組BRET篩選實(shí)驗(yàn)。初篩時，作者獲得了246個阻斷劑小分子和108個促進(jìn)劑小分子。
接下來，作者以EC50≤30 μM作為cutoff，在初篩結(jié)果中進(jìn)一步挑選了24個阻斷劑分子和12個促進(jìn)劑分子。接下來，作者以早先設(shè)計的正交BRET實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，最終的篩選結(jié)果包括5個阻斷劑分子和4個促進(jìn)劑分子。這些分子的細(xì)胞毒性均較低，也沒有影響β-gal本身的活性。在篩選過程中，作者意外發(fā)現(xiàn)化合物4在β-gal實(shí)驗(yàn)中抑制了視紫紅質(zhì)二聚，而在BRET實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)了二聚。
隨后，作者測定了加入阻斷劑/促進(jìn)劑小分子后，異視紫紅質(zhì)（全順式視黃醛）的紫外吸收譜與DMSO對照組相比幾乎無變化，說明這些小分子沒有影響視紫紅質(zhì)本身基態(tài)到meta II中間態(tài)的躍遷。但這些小分子影響了光照激發(fā)后的生色團(tuán)釋放，作者推測這些小分子可能與關(guān)鍵生色殘基Trp265之間存在π-π相互作用或存在空間異構(gòu)結(jié)合影響meta II中間態(tài)回到基態(tài)的速率。之后，作者通過ex vivo ERG（視網(wǎng)膜電圖）實(shí)驗(yàn)測定了代表性阻斷劑分子化合物7和代表性促進(jìn)劑分子化合物1對視桿細(xì)胞光響應(yīng)靈敏度和動力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)化合物7顯著影響了光響應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)，化合物1導(dǎo)致了視桿細(xì)胞光靈敏度的下降。
總而言之，本文作者通過β-gal和BRET策略篩選小分子庫，得到了9個對視紫紅質(zhì)二聚具有促進(jìn)/抑制作用的小分子。作者通過光譜和動力學(xué)性質(zhì)測定推測這些小分子可能與關(guān)鍵生色殘基Trp265之間存在π-π相互作用或存在空間異構(gòu)結(jié)合影響meta II中間態(tài)回到基態(tài)的速率發(fā)揮作用。然而作者也發(fā)現(xiàn)他們篩選得到的小分子在in vivo實(shí)驗(yàn)中效果不及預(yù)期明顯，同時由于二聚的視紫紅質(zhì)在視網(wǎng)膜中廣泛存在，實(shí)驗(yàn)需要的小分子濃度在μM級，可能會對本征生理活動產(chǎn)生干擾。
本文作者：ZSR
責(zé)任編輯：LDY
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.101401
文章引用：DOI：10.1016/j.jbc.2021.101401
