導(dǎo)語：自然進(jìn)化產(chǎn)生了兩種醛縮酶：I型醛縮酶和II型醛縮酶。其中，利用高度保守的ε-氨基，I型醛縮酶通過共價(jià)形成的席夫堿活化aldol donor，隨后形成高度親核的烯胺物種；相反地，在II型醛縮酶中，金屬輔因子（通常是Zn2+）作為Lewis酸通過與羰基絡(luò)合來活化aldol donor，促進(jìn)去質(zhì)子化作用和烯醇化合物的形成。I型醛縮酶可以催化不對(duì)稱aldol反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于手性β-羥基酮的合成。在aldol反應(yīng)中，一般以烯醇化的醛或酮作為親核給體（aldol donor），而酮作為親電受體（aldol acceptor）（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 71, 253; Trends Biochem. Sci. 1992, 17, 110）
研究現(xiàn)狀
盡管可以通過蛋白質(zhì)工程或新蛋白的發(fā)現(xiàn)等克服某些限制，然而，到目前為止，I型醛縮酶DERA（2-deoxy-D-ribose-5-phosphatealdolase）在機(jī)制相關(guān)的碳化反應(yīng)如Morita-Baylis-Hillman、Michael、Mannich、Knoevenagel和Henry-type反應(yīng)中的應(yīng)用仍未被發(fā)現(xiàn)。如Scheme 1a所示，野生型DERA醛縮酶可以催化乙醛和D-甘油醛-3-磷酸的aldol反應(yīng)。盡管DERA可以接受一些小的醛、酮如丙醛、丙酮和氟丙酮作為aldol donors，但是該酶有限的親核范圍限制了其更廣泛的應(yīng)用。此外，DERA催化非磷酸化aldol acceptors的效率較低，在工業(yè)乙醛濃度下，該酶的失活進(jìn)一步限制了它的應(yīng)用。
本文進(jìn)展
近日，Gerrit J. Poelarends課題組在《ACS catalysis》上發(fā)表題為“Unlocking Asymmetric Michael Additions in an Archetypical Class I Aldolaseby Directed Evolution”的論文，（ACS Catal. 2021, 11, 13236?13243）報(bào)道了來源于大腸桿菌的經(jīng)典I型醛縮酶DERA經(jīng)過重新設(shè)計(jì)可以有效催化硝基甲烷與α,β-不飽和醛的Michael加成反應(yīng)，反應(yīng)生成了各種具有藥效團(tuán)的手性合成子。
Scheme 1. 通過酶結(jié)合的烯胺或亞胺離子中間體進(jìn)行的DERA催化的碳化反應(yīng)。（a）DERA催化的乙醛和D-甘油醛-3-磷酸生成2-脫氧-D-核糖-5-磷酸的aldol反應(yīng)，與酶結(jié)合的底物被活化成為親核的烯胺中間體；（b）DERA催化的硝基甲烷2和α,β-不飽和醛1a?j生成γ-硝基醛3a?j的Michael加成反應(yīng)，酶結(jié)合的底物作為親電的亞胺離子中間體被活化。參與反應(yīng)的nucleophilic donor底物用藍(lán)色突出顯示，而electrophilic acceptor底物用紅色突出顯示。
（來源：ACS Catal.）
DERA的定向進(jìn)化
野生型DERA不能催化天然供體乙醛和非天然受體反式-硝基苯乙烯的Michael加成反應(yīng)；但可以催化硝基甲烷2與肉桂醛1a的Michael加成反應(yīng)（e.r. = 96:4，38%轉(zhuǎn)化率）。經(jīng)過11輪定向進(jìn)化，重新設(shè)計(jì)的DERA酶（DERA-MA）的12個(gè)氨基酸殘基被突變，與野生型相比，其催化活性提高了190倍。對(duì)非生物反應(yīng)的高催化效率使DERA-MA成為具有生物催化潛力的一種“Michaelase”。野生型醛縮酶通過激活作為親核試劑的酶結(jié)合底物（基于烯胺機(jī)制）發(fā)揮作用，而DERA-MA則通過激活作為親電試劑的酶結(jié)合底物（基于亞胺機(jī)制）發(fā)揮作用。
圖1 DERA的定向進(jìn)化
（來源：ACS Catal.）
DERA-MA催化2和1a的Michael加成反應(yīng)的效率比之前改造的互變異構(gòu)酶4-OT突變體（ACS Catal. 2019, 9, 4369）高100倍。4-OT為對(duì)稱的同型六聚體，任何點(diǎn)突變都反映在六個(gè)亞基上，這給其優(yōu)化帶來了明顯的限制。DERA的TIM桶狀折疊結(jié)構(gòu)更容易被優(yōu)化，使改造的DERA-MA成為一個(gè)高效的“Michaelase”。當(dāng)DERA-MA 167位的賴氨酸被亮氨酸取代時(shí)，催化活性降低了150倍。實(shí)驗(yàn)表明在DERA-MA催化2和1a的Michael加成反應(yīng)中，K167通過形成一個(gè)亞胺離子激活1a，隨后親核進(jìn)攻2（在去質(zhì)子化后）形成一個(gè)新的碳-碳鍵，即K167具有催化席夫堿形成的重要功能。
DERA-MA的結(jié)構(gòu)
圖2 DERA-MA的晶體結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)
（來源：ACS Catal.）
為了解釋DERA的催化機(jī)制，作者解析了DERA 的X射線衍射結(jié)構(gòu)。DERA-MA的整體結(jié)構(gòu)與野生型DERA幾乎相同，催化賴氨酸K167靠近保守的K201和D102，K201和D102在DERA的天然催化機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。DERA-MA（粉色）中l(wèi)oop β1-α2和β7-α8相對(duì)于野生型DERA具有顯著的構(gòu)象差異（圖2a）。β1-α2的構(gòu)象變化最大，可能受到周圍突變C47S、F52S和K172L（綠色）的影響。野生型DERA和DERA-MA突變體的活性活性中心的結(jié)構(gòu)（圖2b）顯示出β1-α2環(huán)的構(gòu)象差異，以及L20從朝內(nèi)（DERA-WT）向朝外（DERA-MA）位置的位移轉(zhuǎn)變。肉桂醛浸泡的DERA-MA的活性位點(diǎn)（圖2c）顯示K167與苯亞烯丙基（黃色）的共價(jià)席夫堿中間體，同時(shí)還顯示出D102和K201的保守活性位點(diǎn)殘基的側(cè)鏈。DERA-MA中苯亞烯丙基的結(jié)合口袋（圖2d）顯示出席夫堿中間體和周圍殘基的側(cè)鏈。總的來說，DERA-MA的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)（結(jié)合底物或無底物）揭示了突變體是如何重塑活性位點(diǎn)處底物結(jié)合的口袋以容納α,β-不飽和醛并將其導(dǎo)向保守的催化性賴氨酸，從而形成共價(jià)席夫堿中間體。
表1 生物催化劑DERA-MA對(duì)映選擇性合成γ-硝基醛
（來源：ACS Catal.）
DERA-MA的底物范圍
DERA-MA具有廣泛的底物范圍，可以接受芳香環(huán)上各種供電子或吸電子取代的肉桂醛（表1a）。DERA-MA可以接受在鄰/間/對(duì)位具有吸電子取代基的醛化合物1a?d，以及對(duì)于空間上具有嚴(yán)格要求且鄰/間/對(duì)位具有給電子取代基的醛化合物1e?g（盡管1e?g的活性和立體選擇性略微下降）；間位取代的醛1h?j同樣可以被 DERA-MA催化。值得注意的是，α,β-不飽和酮1l不能被改造的酶所催化，這說明了DERA-MA偏好催化α,β-不飽和醛發(fā)生Michael加成反應(yīng)。
最后，作者利用DERA-MA以高轉(zhuǎn)化率（89% ->99%）、高選擇性（e.r. = 99:1）和較好的分離產(chǎn)率（高達(dá)66%）半制備級(jí)催化合成了γ-硝基醛R-3a,d,h（表1b）。值得注意的是，R-3a,d,h是具有價(jià)值的合成前體，其通過兩個(gè)簡單步驟，可以很容易地轉(zhuǎn)化為具有藥物活性的γ-氨基丁酸phenibut、baclofen和fluorophenibut。
綜上，這項(xiàng)工作展示了通過定向進(jìn)化擴(kuò)大天然醛縮酶的反應(yīng)范圍，使其可用于不對(duì)稱Michael加成反應(yīng)，為探索由DERA-MA衍生的催化劑催化亞胺提供了機(jī)會(huì)。
論文信息：
Unlocking Asymmetric Michael Additions in an Archetypical Class I Aldolase by Directed Evolution
Andreas Kunzendorf,§ Guangcai Xu,§ Jesse J. H. van der Velde, Henri?tte J. Rozeboom, Andy-Mark W. H. Thunnissen, and Gerrit J. Poelarends*
