通訊單位：中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
論文DOI：10.1021/acscatal.1c05306
本文通過(guò)設(shè)計(jì)不同的氫酶-電極界面，分析了電極界面表面電荷、非轉(zhuǎn)化信號(hào)、電子轉(zhuǎn)移數(shù)和酶構(gòu)象四者之間的關(guān)系，預(yù)測(cè)了氫酶在不同碳納米管修飾電極上存在的取向，獲得了氫酶與電極最優(yōu)結(jié)合方式，提高了界面電子傳遞速率。
生物酶-電極界面研究在生物電池、生物傳感和生物電合成等方面都有重要的作用。構(gòu)建高效的酶-電極界面，促進(jìn)電子傳遞與傳質(zhì)，設(shè)計(jì)性能優(yōu)越的生物電子設(shè)備，成為生物電化學(xué)系統(tǒng)重要的研究?jī)?nèi)容。在酶-電極構(gòu)建過(guò)程中，為獲得高效生物電子傳遞，需設(shè)計(jì)一定的結(jié)合驅(qū)動(dòng)力、合理的酶-電極交互方式和穩(wěn)定的界面微環(huán)境。根據(jù)Marcus電子傳遞理論，傳遞距離和電勢(shì)差是制約傳遞速率的重要因素。由于酶分子復(fù)雜的表面理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)組成，研究酶-電極界面上酶與電極的結(jié)合方式和互作機(jī)制，使酶以特定空間取向固定于電極，對(duì)實(shí)現(xiàn)高效生物電子傳遞和提高酶-電極性能具有重要意義。來(lái)源于Pyrococcus furiosus胞質(zhì)可溶性氫酶PfSHI是一個(gè)具有高熱穩(wěn)定性的雙向氫酶，它由四個(gè)亞基組成，即：包含[NiFe]活性中心的大亞基(α)，包含3個(gè)鐵硫簇的小亞基(δ)，具有兩個(gè)鐵硫簇的亞基(β)和結(jié)合了1個(gè)FAD和1個(gè)2Fe-2S的亞基(γ)。在以往的研究中，PfSHI常用于產(chǎn)氫和再生輔酶。由于其優(yōu)異的催化活性、穩(wěn)定性和氧耐受性，PfSHI在構(gòu)建氫氧燃料電池方面也具有很大的潛能。然而，基于將酶共價(jià)結(jié)合到碳納米管上構(gòu)建成生物燃料電池的陽(yáng)極，由于PfSHI在電極上隨機(jī)的取向，電極上酶的有效連接只占總固定酶的10%左右。此外，該四亞基氫酶由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，晶體結(jié)構(gòu)尚未被解析，使研究其與電極的界面結(jié)合與互作機(jī)制變得復(fù)雜。本研究對(duì)PfSHI酶分子內(nèi)非勻質(zhì)電子傳遞通道和界面間電子傳遞通道進(jìn)行不斷的深入研究，將酶的活性中心盡可能的接近電極表面。通過(guò)理性設(shè)計(jì)酶-電極界面，研究了酶在電極表面上的多種微觀構(gòu)象，建立了多個(gè)酶-電極耦合模型，并對(duì)各個(gè)模型進(jìn)行了相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的擬合和計(jì)算，設(shè)計(jì)出了最優(yōu)的一組酶-電極界面和最短的電子傳遞通路。▲圖1. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE界面電化學(xué)表征。a. PfSHI結(jié)構(gòu)示意圖。b. 電極在PfSHI電解液中進(jìn)行連續(xù)循環(huán)伏安掃描。c. 循環(huán)伏安法驗(yàn)證酶電極的非轉(zhuǎn)化信號(hào)，左：1-50 圈在含酶電解液中測(cè)試，右：1-25 在含有酶的電解液中測(cè)試，26-50轉(zhuǎn)移至不含酶緩沖液中。d. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE形式電位與pH 的線性關(guān)系。e. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE在pH 7.0下的非轉(zhuǎn)化信號(hào)。f. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE在pH 10.0下的非轉(zhuǎn)化信號(hào)。
研究中，將PfSHI固定到碳納米管，獲得了其非轉(zhuǎn)化電流信號(hào)，通過(guò)研究非轉(zhuǎn)化信號(hào)形成過(guò)程及與pH 之間的關(guān)系，驗(yàn)證了酶-電極界面電化學(xué)反應(yīng)是一個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移耦合電子轉(zhuǎn)移(PCET)的過(guò)程。通過(guò)進(jìn)一步分析PfSHI的結(jié)構(gòu)模型，可知酶與電極界面相交的結(jié)構(gòu)域?yàn)棣脕喕浣Y(jié)合輔因子FAD和[2Fe-2S]2+/1+接近于酶表面且能與電極進(jìn)行電子傳遞(圖1)。▲圖2. PfSHI 氫酶γ亞基示意圖。a. γ亞基模型。b. PfSHI固定到Pristine-MWCNTs/GCE的微觀構(gòu)象。
通過(guò)分析模型可知，F(xiàn)AD和[2Fe-2S]2+/1+都分布在γ亞基的表面附近，所以這兩個(gè)非轉(zhuǎn)化信號(hào)很容易能被檢測(cè)出來(lái)，F(xiàn)AD與[2Fe-2S]2+/1+的距離為12.8 ?，這個(gè)距離也能使電子快速?gòu)腫2Fe-2S]2+/1+傳遞到FAD(圖2)。▲圖3. PfSHI在正電(Pos-MWCNTs )和負(fù)電(Neg-MWCNTs) 碳納米管修飾電極表面電化學(xué)性質(zhì)表征。a. Pos-MWCNTs和Neg-MWCNTs結(jié)構(gòu)示意圖。b. Pos-MWCNTs和Neg-MWCNTs的Zeta電位分析。c. PfSHI/Pos-MWCNTs/GCE和PfSHI/Neg-MWCNTs/GCE形式電位與pH 的線性關(guān)系。d. PfSHI在Neg-MWCNTs (左) 和Pos-MWCNTs (右)上的構(gòu)象示意圖。e. 碳納米管修飾酶電極界面間電子傳遞個(gè)數(shù)。
為了研究靜電作用力在酶-電極界面形成過(guò)程中發(fā)揮的作用，將PfSHI 固定到帶正電和帶負(fù)電的MWCNTs 修飾的玻碳電極上，并對(duì)各電極進(jìn)行了直接電化學(xué)表征。通過(guò)分析電極界面電極表面電荷、非轉(zhuǎn)化信號(hào)、電子轉(zhuǎn)移數(shù)和酶構(gòu)象四者之間的關(guān)系，預(yù)測(cè)了酶在不同帶電碳納米管修飾的電極上存在的不同構(gòu)象。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)對(duì)電極的非轉(zhuǎn)化峰進(jìn)行積分，計(jì)算了界面電子轉(zhuǎn)移數(shù)，證明了PfSHI在電極上的形態(tài)受電極表面靜電影響。▲圖4. PfSHI修飾電極的氧化催化電流與定向固定。a. 不同pH條件下氧化催化電流。b.氧化電流0 V處DET/MET比值大小與pH值的關(guān)系。c. CV 曲線正掃部分動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果。d. 三種碳納米管的水滴角測(cè)試親疏水性。
通過(guò)氫氧化電流大小和循環(huán)伏安曲線擬合分析，PfSHI/Neg-MWCNTs/GCE和PfSHI/Pos-MWCNTs/GCE的直接/間接催化電流比率和其“S”型曲線都弱于PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE，PfSHI固定到Pristine-MWCNTs/GCE電極上獲得了高效的界面電子傳遞效率。利用水滴角度測(cè)量?jī)x對(duì)三種碳納米管的表面親疏水性進(jìn)行了測(cè)試，Pristine-WMCNTs的疏水性最好，Neg-MWCNTs次之，Pos-MWCNTs的疏水性最差，酶定向固定的比率與三種碳納米管的直接/間接催化性能一致。因此，疏水電極表面能使PfSHI獲得最佳取向，PfSHI分子在電極上的取向和電催化電流是靜電作用和疏水相互作用的協(xié)同效應(yīng)。▲圖5. PfSHI在電極上定向固定與吸附動(dòng)力學(xué)研究。a. Pristine-MWCNTsox/GCE的電化學(xué)表征結(jié)果與親疏水測(cè)試。b. PfSHI/Pristine-MWCNTsox/GCE氧化催化循環(huán)伏安曲線。c和d.循環(huán)伏安法表征酸性環(huán)境對(duì)酶電極界面的影響。e和f. QCM測(cè)試碳納米管對(duì)PfSHI吸附動(dòng)力學(xué)。g. PfSHI 在疏水電極表面吸附示意圖。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證疏水作用力對(duì)酶的定向作用，對(duì)Pristine-MWCNTs進(jìn)行親水化處(Pristine-MWCNTsox)。親水化修飾后的Pristine-MWCNTsox電極酶固定量變化不大，但定向效果變差。另外，酸性條件下，PfSHI/Pristine-MWCNTs電極界面的酶γ亞基與電極相結(jié)合的部分會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變形，導(dǎo)致酶電極界面最佳結(jié)合損壞，定向固定效果減弱。根據(jù)QCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行推測(cè)，電場(chǎng)作用力下，PfSHI在Pristine-MWCNTs修飾電極的吸附過(guò)程分成兩個(gè)階段。在電場(chǎng)作用力下，PfSHI在溶液本體中向電極表面靠近，此時(shí)酶的排列是無(wú)序的；當(dāng)PfSHI到達(dá)電極表面一定距離時(shí)，疏水作用力發(fā)揮作用，PfSHI分子在γ亞基疏水表面與電極表面疏水作用力的吸引下進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，隨后酶在電極上固定，PfSHI分子在電極上最終形成均一構(gòu)象。針對(duì)PfSHI酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以進(jìn)行理性設(shè)計(jì)達(dá)到定性固定的問(wèn)題，本文通過(guò)構(gòu)建不同的酶-電極界面，分別研究了親疏水作用力、靜電作用力、酸堿性等條件下的界面構(gòu)型，預(yù)測(cè)了PfSHI-電極界面微觀結(jié)構(gòu)，建立了復(fù)雜酶-電極界面系統(tǒng)的電化學(xué)分析方法，特別是具有多個(gè)亞基但沒(méi)有晶體結(jié)構(gòu)的酶的界面研究方法，并基于電化學(xué)相關(guān)計(jì)算，對(duì)分子內(nèi)電子傳遞過(guò)程和酶表觀動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了研究，為復(fù)雜的酶-電極體系的研究提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/span>朱之光，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員，博士生導(dǎo)師，中科院人才計(jì)劃入選者。近年來(lái)獲得重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、天津市自然科學(xué)基金、中科院重點(diǎn)部署項(xiàng)目等支持。曾在Chemical Reviews、Nature Communications、Angewandte Chemie、ACS Catalysis、Biosensors & Bioelectronics等知名國(guó)際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文50余篇，引用2000余次，h指數(shù)19，專(zhuān)利6項(xiàng)。課題組主要利用生物工程、合成生物學(xué)和生物電化學(xué)的方法和原理，研究生物催化與電子傳遞相關(guān)科學(xué)問(wèn)題。通過(guò)酶設(shè)計(jì)改造、電子傳遞強(qiáng)化、以及生物-納米介面調(diào)控等策略，構(gòu)建高效、穩(wěn)定的生物燃料電池、生物電化學(xué)合成、生物傳感等生物電能應(yīng)用系統(tǒng)。課題組長(zhǎng)期招聘分子生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、生物電化學(xué)等背景的工作人員和客座學(xué)生，對(duì)此方向感興趣歡迎郵件聯(lián)系（zhu_zg@tib.cas.cn），https://www.x-mol.com/groups/zhuzhiguang。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c05306
