通訊單位：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
論文DOI：10.1021/acscatal.1c05306
本文通過設(shè)計不同的氫酶-電極界面，分析了電極界面表面電荷、非轉(zhuǎn)化信號、電子轉(zhuǎn)移數(shù)和酶構(gòu)象四者之間的關(guān)系，預(yù)測了氫酶在不同碳納米管修飾電極上存在的取向，獲得了氫酶與電極最優(yōu)結(jié)合方式，提高了界面電子傳遞速率。
生物酶-電極界面研究在生物電池、生物傳感和生物電合成等方面都有重要的作用。構(gòu)建高效的酶-電極界面，促進電子傳遞與傳質(zhì)，設(shè)計性能優(yōu)越的生物電子設(shè)備，成為生物電化學(xué)系統(tǒng)重要的研究內(nèi)容。在酶-電極構(gòu)建過程中，為獲得高效生物電子傳遞，需設(shè)計一定的結(jié)合驅(qū)動力、合理的酶-電極交互方式和穩(wěn)定的界面微環(huán)境。根據(jù)Marcus電子傳遞理論，傳遞距離和電勢差是制約傳遞速率的重要因素。由于酶分子復(fù)雜的表面理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)組成，研究酶-電極界面上酶與電極的結(jié)合方式和互作機制，使酶以特定空間取向固定于電極，對實現(xiàn)高效生物電子傳遞和提高酶-電極性能具有重要意義。來源于Pyrococcus furiosus胞質(zhì)可溶性氫酶PfSHI是一個具有高熱穩(wěn)定性的雙向氫酶，它由四個亞基組成，即：包含[NiFe]活性中心的大亞基(α)，包含3個鐵硫簇的小亞基(δ)，具有兩個鐵硫簇的亞基(β)和結(jié)合了1個FAD和1個2Fe-2S的亞基(γ)。在以往的研究中，PfSHI常用于產(chǎn)氫和再生輔酶。由于其優(yōu)異的催化活性、穩(wěn)定性和氧耐受性，PfSHI在構(gòu)建氫氧燃料電池方面也具有很大的潛能。然而，基于將酶共價結(jié)合到碳納米管上構(gòu)建成生物燃料電池的陽極，由于PfSHI在電極上隨機的取向，電極上酶的有效連接只占總固定酶的10%左右。此外，該四亞基氫酶由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，晶體結(jié)構(gòu)尚未被解析，使研究其與電極的界面結(jié)合與互作機制變得復(fù)雜。本研究對PfSHI酶分子內(nèi)非勻質(zhì)電子傳遞通道和界面間電子傳遞通道進行不斷的深入研究，將酶的活性中心盡可能的接近電極表面。通過理性設(shè)計酶-電極界面，研究了酶在電極表面上的多種微觀構(gòu)象，建立了多個酶-電極耦合模型，并對各個模型進行了相關(guān)動力學(xué)參數(shù)的擬合和計算，設(shè)計出了最優(yōu)的一組酶-電極界面和最短的電子傳遞通路。▲圖1. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE界面電化學(xué)表征。a. PfSHI結(jié)構(gòu)示意圖。b. 電極在PfSHI電解液中進行連續(xù)循環(huán)伏安掃描。c. 循環(huán)伏安法驗證酶電極的非轉(zhuǎn)化信號，左：1-50 圈在含酶電解液中測試，右：1-25 在含有酶的電解液中測試，26-50轉(zhuǎn)移至不含酶緩沖液中。d. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE形式電位與pH 的線性關(guān)系。e. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE在pH 7.0下的非轉(zhuǎn)化信號。f. PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE在pH 10.0下的非轉(zhuǎn)化信號。
研究中，將PfSHI固定到碳納米管，獲得了其非轉(zhuǎn)化電流信號，通過研究非轉(zhuǎn)化信號形成過程及與pH 之間的關(guān)系，驗證了酶-電極界面電化學(xué)反應(yīng)是一個質(zhì)子轉(zhuǎn)移耦合電子轉(zhuǎn)移(PCET)的過程。通過進一步分析PfSHI的結(jié)構(gòu)模型，可知酶與電極界面相交的結(jié)構(gòu)域為γ亞基，其結(jié)合輔因子FAD和[2Fe-2S]2+/1+接近于酶表面且能與電極進行電子傳遞(圖1)。▲圖2. PfSHI 氫酶γ亞基示意圖。a. γ亞基模型。b. PfSHI固定到Pristine-MWCNTs/GCE的微觀構(gòu)象。
通過分析模型可知，F(xiàn)AD和[2Fe-2S]2+/1+都分布在γ亞基的表面附近，所以這兩個非轉(zhuǎn)化信號很容易能被檢測出來，F(xiàn)AD與[2Fe-2S]2+/1+的距離為12.8 ?，這個距離也能使電子快速從[2Fe-2S]2+/1+傳遞到FAD(圖2)。▲圖3. PfSHI在正電(Pos-MWCNTs )和負電(Neg-MWCNTs) 碳納米管修飾電極表面電化學(xué)性質(zhì)表征。a. Pos-MWCNTs和Neg-MWCNTs結(jié)構(gòu)示意圖。b. Pos-MWCNTs和Neg-MWCNTs的Zeta電位分析。c. PfSHI/Pos-MWCNTs/GCE和PfSHI/Neg-MWCNTs/GCE形式電位與pH 的線性關(guān)系。d. PfSHI在Neg-MWCNTs (左) 和Pos-MWCNTs (右)上的構(gòu)象示意圖。e. 碳納米管修飾酶電極界面間電子傳遞個數(shù)。
為了研究靜電作用力在酶-電極界面形成過程中發(fā)揮的作用，將PfSHI 固定到帶正電和帶負電的MWCNTs 修飾的玻碳電極上，并對各電極進行了直接電化學(xué)表征。通過分析電極界面電極表面電荷、非轉(zhuǎn)化信號、電子轉(zhuǎn)移數(shù)和酶構(gòu)象四者之間的關(guān)系，預(yù)測了酶在不同帶電碳納米管修飾的電極上存在的不同構(gòu)象。為了進一步驗證，實驗對電極的非轉(zhuǎn)化峰進行積分，計算了界面電子轉(zhuǎn)移數(shù)，證明了PfSHI在電極上的形態(tài)受電極表面靜電影響。▲圖4. PfSHI修飾電極的氧化催化電流與定向固定。a. 不同pH條件下氧化催化電流。b.氧化電流0 V處DET/MET比值大小與pH值的關(guān)系。c. CV 曲線正掃部分動力學(xué)擬合結(jié)果。d. 三種碳納米管的水滴角測試親疏水性。
通過氫氧化電流大小和循環(huán)伏安曲線擬合分析，PfSHI/Neg-MWCNTs/GCE和PfSHI/Pos-MWCNTs/GCE的直接/間接催化電流比率和其“S”型曲線都弱于PfSHI/Pristine-MWCNTs/GCE，PfSHI固定到Pristine-MWCNTs/GCE電極上獲得了高效的界面電子傳遞效率。利用水滴角度測量儀對三種碳納米管的表面親疏水性進行了測試，Pristine-WMCNTs的疏水性最好，Neg-MWCNTs次之，Pos-MWCNTs的疏水性最差，酶定向固定的比率與三種碳納米管的直接/間接催化性能一致。因此，疏水電極表面能使PfSHI獲得最佳取向，PfSHI分子在電極上的取向和電催化電流是靜電作用和疏水相互作用的協(xié)同效應(yīng)。▲圖5. PfSHI在電極上定向固定與吸附動力學(xué)研究。a. Pristine-MWCNTsox/GCE的電化學(xué)表征結(jié)果與親疏水測試。b. PfSHI/Pristine-MWCNTsox/GCE氧化催化循環(huán)伏安曲線。c和d.循環(huán)伏安法表征酸性環(huán)境對酶電極界面的影響。e和f. QCM測試碳納米管對PfSHI吸附動力學(xué)。g. PfSHI 在疏水電極表面吸附示意圖。
為了進一步驗證疏水作用力對酶的定向作用，對Pristine-MWCNTs進行親水化處(Pristine-MWCNTsox)。親水化修飾后的Pristine-MWCNTsox電極酶固定量變化不大，但定向效果變差。另外，酸性條件下，PfSHI/Pristine-MWCNTs電極界面的酶γ亞基與電極相結(jié)合的部分會發(fā)生結(jié)構(gòu)變形，導(dǎo)致酶電極界面最佳結(jié)合損壞，定向固定效果減弱。根據(jù)QCM實驗結(jié)果進行推測，電場作用力下，PfSHI在Pristine-MWCNTs修飾電極的吸附過程分成兩個階段。在電場作用力下，PfSHI在溶液本體中向電極表面靠近，此時酶的排列是無序的；當PfSHI到達電極表面一定距離時，疏水作用力發(fā)揮作用，PfSHI分子在γ亞基疏水表面與電極表面疏水作用力的吸引下進行翻轉(zhuǎn)，隨后酶在電極上固定，PfSHI分子在電極上最終形成均一構(gòu)象。針對PfSHI酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以進行理性設(shè)計達到定性固定的問題，本文通過構(gòu)建不同的酶-電極界面，分別研究了親疏水作用力、靜電作用力、酸堿性等條件下的界面構(gòu)型，預(yù)測了PfSHI-電極界面微觀結(jié)構(gòu)，建立了復(fù)雜酶-電極界面系統(tǒng)的電化學(xué)分析方法，特別是具有多個亞基但沒有晶體結(jié)構(gòu)的酶的界面研究方法，并基于電化學(xué)相關(guān)計算，對分子內(nèi)電子傳遞過程和酶表觀動力學(xué)過程進行了研究，為復(fù)雜的酶-電極體系的研究提供了理論基礎(chǔ)和實驗?zāi)Ｐ汀?/span>朱之光，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員，博士生導(dǎo)師，中科院人才計劃入選者。近年來獲得重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、天津市自然科學(xué)基金、中科院重點部署項目等支持。曾在Chemical Reviews、Nature Communications、Angewandte Chemie、ACS Catalysis、Biosensors & Bioelectronics等知名國際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文50余篇，引用2000余次，h指數(shù)19，專利6項。課題組主要利用生物工程、合成生物學(xué)和生物電化學(xué)的方法和原理，研究生物催化與電子傳遞相關(guān)科學(xué)問題。通過酶設(shè)計改造、電子傳遞強化、以及生物-納米介面調(diào)控等策略，構(gòu)建高效、穩(wěn)定的生物燃料電池、生物電化學(xué)合成、生物傳感等生物電能應(yīng)用系統(tǒng)。課題組長期招聘分子生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、生物電化學(xué)等背景的工作人員和客座學(xué)生，對此方向感興趣歡迎郵件聯(lián)系（zhu_zg@tib.cas.cn），https://www.x-mol.com/groups/zhuzhiguang。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c05306
