第一作者：麻光磊
通訊作者：梁照珣教授
通訊單位：新加坡南洋理工大學(xué)
論文DOI：https://doi.org/10.1021/jacs.1c10369
本研究報(bào)道了一類微生物來源的結(jié)構(gòu)新穎的含腙類環(huán)肽成分，并從生物合成角度解析了該類天然腙基的合成機(jī)制，即為基于體內(nèi)重氮化和Japp-Klingemann偶聯(lián)反應(yīng)的新機(jī)制。腙基（-N-N=C-）因其高效易得的反應(yīng)特性常作為模塊化的連接基團(tuán)或先導(dǎo)結(jié)構(gòu)應(yīng)用到藥物遞送、光敏試劑及新環(huán)系構(gòu)筑等系統(tǒng)當(dāng)中。盡管腙基類化合物已被藥物/有機(jī)化學(xué)家和材料科學(xué)家廣泛合成，但天然來源的含腙基化合物鮮有報(bào)道，對(duì)它們的生物合成機(jī)制更是知之甚少。近年來，雖屢有催化N-N鍵形成的新酶系報(bào)道，但其產(chǎn)物均為合成通路的終產(chǎn)物且結(jié)構(gòu)多為烷基肼類而非芳香類。而本研究首次詳實(shí)地報(bào)道一類可催化N-N鍵形成重氮化芳香產(chǎn)物的新型酶Aha11，該高反應(yīng)活性的重氮化產(chǎn)物可進(jìn)一步與醛基類環(huán)肽前體發(fā)生體內(nèi)的Japp-Klingemann偶聯(lián)反應(yīng)形成腙基結(jié)構(gòu)，展示出了生物體內(nèi)重氮化修飾所具有的重要衍生化優(yōu)勢(shì)和潛力，為芳香類化合物的合成生物學(xué)研究提供了更多的思路。本部分，因研究內(nèi)容的行文思路和詳細(xì)的結(jié)果展示已在英文原文中或相關(guān)的文章推送中一一陳述，在這里不再累述。此處，筆者將從實(shí)驗(yàn)員的角度出發(fā)，主要針對(duì)工作在第一線的年輕的研究生學(xué)者們，對(duì)于實(shí)驗(yàn)方案實(shí)施過程中遇到的棘手問題，以問題挑戰(zhàn)和應(yīng)對(duì)策略的形式，對(duì)該項(xiàng)研究進(jìn)行扼要的內(nèi)容梳理并附帶部分感想和體會(huì)，希望對(duì)正處于課題研究當(dāng)中的研究生們有所裨益。本研究內(nèi)容歷時(shí)多年，由課題組成員通力合作完成，因此內(nèi)容較為充實(shí)和完整，比較系統(tǒng)地解析和闡述了一類腙基天然成分的生物合成機(jī)制。而整個(gè)課題的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究進(jìn)度是逐步推進(jìn)、循序漸進(jìn)的。研究的內(nèi)容也是從點(diǎn)及線、再到面逐步去延伸的，從新結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)解析、生物合成基因簇的確定到關(guān)鍵酶的鎖定、體外活性表征，從關(guān)鍵多肽前體的追蹤、鑒定到最終體外構(gòu)筑整個(gè)分子骨架，個(gè)中雖遇到了多種困難挑戰(zhàn)所幸最終都一一化解，并從中獲益匪淺。4.1 天然腙基類環(huán)肽成分Tasikamides的發(fā)現(xiàn)和鑒定新穎天然產(chǎn)物的快速發(fā)現(xiàn)始終是天然產(chǎn)物領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)。近年來基因信息學(xué)的發(fā)展為新穎結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)提供了新的思路和方法，但多數(shù)生物合成基因簇（BGC）的沉默現(xiàn)象卻成為了一個(gè)新的難點(diǎn)。因此，在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過程中仍需結(jié)合傳統(tǒng)方法（化學(xué)篩查、活性導(dǎo)向），聯(lián)合運(yùn)用多種手段去高效地發(fā)現(xiàn)新穎成分。本課題主要采用的是代謝產(chǎn)物的化學(xué)導(dǎo)向分析方法從鏈霉菌P46中發(fā)現(xiàn)了該類新穎的tasikamides。在結(jié)構(gòu)鑒定上，腙基官能團(tuán)中N-N鍵由于存在兩個(gè)連續(xù)的氮原子，依靠傳統(tǒng)的1H和13C NMR測試是較難確定其結(jié)構(gòu)的，因此，本文采用了15N同位素標(biāo)記方法先獲得15N標(biāo)記的tasikamides，而后通過1H-15N HSQC/HMBC等氮譜NMR測試確定了腙基的結(jié)構(gòu)。目前，同位素標(biāo)記法已廣泛地應(yīng)用到天然產(chǎn)物的鑒定及生物合成研究當(dāng)中，且通過對(duì)比分析同位素標(biāo)記前后代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜差異來尋找特定化合物常會(huì)收獲事半功倍的效果。4.2 參與合成tasikamide A (1)的兩條基因簇的確定Tasikamides結(jié)構(gòu)中包含環(huán)肽母核（TSK）主片段和親脂性鄰氨基苯甲酯(AHA)側(cè)鏈，且兩者之間通過腙基進(jìn)行連接。負(fù)責(zé)合成環(huán)肽母核TSK部分的NRPS生物合成基因簇可通過antiSMASH的預(yù)測分析結(jié)合環(huán)肽的五肽縮合、甲基化、羥基化等結(jié)構(gòu)特征合理推測其應(yīng)為BGC22,當(dāng)然確鑿的證據(jù)需要通過基因敲除和產(chǎn)物分析來佐證。此處的難點(diǎn)為如何確定另一片段AHA的合成基因簇，由于在tsk BGC中，或其臨近的基因區(qū)域內(nèi)，亦或是剩余的所有antiSMASH標(biāo)注的BGC中都無法找到能與AHA結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的合成基因，我們猜想可能是由于負(fù)責(zé)合成AHA的基因片段過小、呈散狀分布或從未表征過而無法被antiSMASH識(shí)別，因?yàn)槲覀兪紫韧茰y了合成AHA片段可能所需的關(guān)鍵基團(tuán)，而后在整個(gè)基因組中對(duì)其進(jìn)行了檢索，從而確定了可能的aha BGC，進(jìn)一步的確認(rèn)我們是通過體外重構(gòu)了AHA的生物合成途徑，該部分工作包含了大量的蛋白純化及體外生化反應(yīng)，對(duì)我們?cè)诘鞍准兓夹g(shù)及生化條件優(yōu)化的技能掌握上是一個(gè)很好的訓(xùn)練，為后續(xù)處理技術(shù)難度較高的問題打下了基礎(chǔ)。
首先是要初步鎖定參與N-N形成的候選酶范圍。該部分的分析預(yù)測需要借用到大量的生物信息學(xué)分析工具和相關(guān)的文獻(xiàn)查閱，最終我們將目標(biāo)聚焦到了aha BGC中額外的三個(gè)基因Aha1,Aha2和Aha11。Aha1和Aha2根據(jù)序列同源性分析推測它們的功能應(yīng)是催化谷氨酸形成亞硝酸（NO2-），為快速的驗(yàn)證該推論我們進(jìn)行15N標(biāo)記的NO2-飼喂實(shí)驗(yàn)，并通過MS和核磁數(shù)據(jù)分析證實(shí)腙基中的中心氮原子來源NO2-,同時(shí)也間接表明Aha1/2參與到了腙基的生物合成途徑中。緊接著便是Aha11的功能確定，由于其極低的同源性特征Blast分析中并沒有得到有用的信息，我們轉(zhuǎn)而進(jìn)行了體內(nèi)基因敲除實(shí)驗(yàn)希望從中尋找突破?？上驳氖?，敲除aha11的菌株不再產(chǎn)生含腙基1-3，而繼續(xù)產(chǎn)生環(huán)肽AHA母核4-7及AHA側(cè)鏈8-10，表明aha11對(duì)腙基中N-N鍵的形成至關(guān)重要，此時(shí)可武斷認(rèn)為aha11具有直接催化N-N鍵形成的作用。當(dāng)然，此推斷需要經(jīng)體外Aha11催化實(shí)驗(yàn)去證實(shí)，同時(shí)基于前述分析我們合理推測參與該N-N鍵形成的含氮底物應(yīng)分別為AHA和NO2-。已確定好參與形成的N-N鍵所需的酶及底物，接下來就是嘗試和優(yōu)化各種生化反應(yīng)條件在體外構(gòu)建出該步反應(yīng)。此處需要大量的閱讀文獻(xiàn)收集相關(guān)的反應(yīng)條件以及與導(dǎo)師及時(shí)進(jìn)行探討交流汲取經(jīng)驗(yàn)。經(jīng)過大量的條件摸索，我們發(fā)現(xiàn)在ATP、Mg2+、NO2-存在的堿性環(huán)境下（pH=8），Aha11可催化AHA（8）與NO2-發(fā)生重氮化反應(yīng)形成重氮化產(chǎn)物diazo-AHA (11)。該過程體會(huì)較深的是，當(dāng)從體外實(shí)驗(yàn)（如關(guān)鍵酶鎖定、條件優(yōu)化）無從下手時(shí)，可先嘗試從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（如基因敲除）入手尋找線索，縮小或鎖定目標(biāo)功能酶；當(dāng)從生物角度無法進(jìn)行預(yù)測難以推動(dòng)時(shí)，可從化學(xué)角度嘗試突破，該體會(huì)在下節(jié)的多肽前體發(fā)現(xiàn)過程中尤為明顯。4.4 含醛基多肽前體14的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)表征Aha11的生物功能及相應(yīng)的重氮化產(chǎn)物11，從化學(xué)結(jié)構(gòu)角度看重氮類化合物11具有非常活潑的反應(yīng)活性，因此我們推測在環(huán)肽結(jié)構(gòu)4-7或其他未知的衍生物中是否會(huì)存在一個(gè)前體的環(huán)肽結(jié)構(gòu)可與11發(fā)生反應(yīng)形成腙基以及化合物1-3。帶著該設(shè)想，我們首先嘗試在體外將重氮化產(chǎn)物11與化合物4-7或混合物餾分（30-40 min）進(jìn)行反應(yīng)，但均未檢測到化合物1-3的產(chǎn)生，原因可能是環(huán)肽混合物中并不存在這樣一個(gè)前體結(jié)構(gòu)或者存在該前體但需要合適的反應(yīng)條件才可發(fā)生。對(duì)于第一個(gè)疑問--是否存在這樣一個(gè)環(huán)肽前體，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)TSK代謝功能喪失的?tskJ的飼喂實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示培養(yǎng)基中加入化合物4-7均不能使?tskJ恢復(fù)產(chǎn)生1-3，而當(dāng)加入混合物（30-40 min餾分）則可以恢復(fù)1-3的產(chǎn)生，表明在混合物中存在一個(gè)可參與合成腙基片段的未知前體。為追蹤該前體結(jié)構(gòu)，我們進(jìn)行了多輪次的液相純化和飼喂實(shí)驗(yàn)并成功導(dǎo)向分離到該前體結(jié)構(gòu)，根據(jù)質(zhì)譜信息及易降解特征推測其結(jié)構(gòu)可能為含有醛基片段的環(huán)肽類成分；為進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)，我們采用了醛基的專屬顏色鑒定反應(yīng)（Schiff test）以及衍生化處理（Brady reagent）方案結(jié)合NMR數(shù)據(jù)確定了其結(jié)構(gòu)為i-butyl片段為β-keto-醛基的環(huán)肽類衍生物14。4.5 Japp-Klingemann偶聯(lián)反應(yīng)完成腙基N=C的形成及tasikamideA的骨架構(gòu)建由形成tasikamideA所需的兩個(gè)片段（重氮化的11和含醛基環(huán)肽結(jié)構(gòu)14）可聯(lián)想到兩者可能是通過Japp-Klingemann偶聯(lián)反應(yīng)形成腙基；同時(shí)，從反應(yīng)機(jī)理上考慮，親核性14應(yīng)在到堿性活性下具有較高的反應(yīng)活性，可與親電性11發(fā)生偶聯(lián)、脫羧、重排等反應(yīng)形成腙基以及tasikamide A (1)。在此指導(dǎo)下，我們?cè)趐H=8的弱堿條件下成功證實(shí)重氮化產(chǎn)物11和14可經(jīng)體外的非酶自發(fā)反應(yīng)形成腙基，即形成化合物1。自此，我們完成了tasikamide A (1)的生物合成途徑詳細(xì)的解析過程，并經(jīng)體外酶催化、非酶自發(fā)反應(yīng)重構(gòu)了腙基的形成過程。值得一提的是，通過Japp-Klingemann反應(yīng)合成腙基結(jié)構(gòu)在化學(xué)合成中較為常用，而意外的是自然界中的生物體竟采用同樣的合成途徑代謝腙基類成分。我們從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了一類含有腙基的新穎環(huán)肽類結(jié)構(gòu)，研究表明該類結(jié)構(gòu)是由兩條生物合成途經(jīng)的產(chǎn)物發(fā)生偶聯(lián)形成。結(jié)構(gòu)中腙基的形成經(jīng)歷了兩個(gè)步驟，Aha11催化的N-N的形成以及Japp-Klingemann偶聯(lián)完成N=C鍵的構(gòu)建。這是Japp-Klingemann偶聯(lián)反應(yīng)首次被報(bào)道在生物體內(nèi)發(fā)生。Aha11所催化N-N鍵形成產(chǎn)物為高活性的芳香重氮化產(chǎn)物，該類結(jié)構(gòu)在合成化學(xué)中常作為重要的中間體參與構(gòu)筑多種芳香類骨架，因此Aha11可作為體內(nèi)構(gòu)建重氮化結(jié)構(gòu)的工具酶應(yīng)用到多種芳香類衍生物的合成生物學(xué)研究當(dāng)中。本文第一作者為南洋理工大學(xué)博士后麻光磊，麻光磊博士2018年畢業(yè)于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)專業(yè)，博士階段的研究方向?yàn)樗幱弥参飦碓吹男路f成分的發(fā)現(xiàn)、修飾及活性評(píng)價(jià)，后加入梁教授課題組開展微生物來源的復(fù)雜天然產(chǎn)物的生物合成研究，目前已發(fā)現(xiàn)和解析了多個(gè)新穎結(jié)構(gòu)的生物合成機(jī)制。新加坡南洋理工大學(xué)生命科學(xué)院梁照珣教授課題組長期致力于: (1）細(xì)菌致病和抗生素耐藥性的分子機(jī)制研究；（2）微生物酶的發(fā)現(xiàn)及合成生物學(xué)研究。歡迎有志于生物化學(xué)與分子生物學(xué)，微生物遺傳學(xué)及天然產(chǎn)物化學(xué)的同學(xué)加盟。https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c10369
