近年來，蛋白質化學合成技術飛速發(fā)展，為解析和調控系列重大生理過程提供了關鍵蛋白質原料。目前，主流的人工蛋白合成采用自然化學連接法（native chemical ligation, NCL）將含N端Cys的蛋白片段與含C端硫酯的蛋白片段進行連接，所需的蛋白/多肽片段則可通過固相合成或者重組表達獲取。內含肽自剪切或酶催化等技術極大地提高了獲取含C端硫酯或其前體——酰肼蛋白片段的效率，但僅限于可溶性蛋白片段，應用門檻較高。因此，開發(fā)更具普適性、可在變性條件下獲取含C端酰肼/硫酯蛋白片段的方法引起了科研人員極大的研究興趣，半胱氨酸側鏈巰基氰基化介導的肼解便是其中最為有效的方法之一。然而該方法的核心——半胱氨酸氰基化，并無位點選擇性，使其難以適用于含半胱氨酸的目標蛋白片段，嚴重地限制了其應用范圍。
近日，華南理工大學化學與化工學院何春茂教授團隊為實現(xiàn)區(qū)域選擇性的半胱氨酸氰基化，提出了可逆正交保護半胱氨酸的設想，于目標蛋白的C端引入特異性識別標簽，并使其滿足三個條件：1）N端為Cys以實現(xiàn)無痕肼解剪切；2）能在變性條件下實現(xiàn)特異性可逆結合；3）氨基酸序列較短以避免影響目標融合蛋白的表達。多肽序列CCXXCC可特異性結合雙砷染料分子FlAsH-EDT2，已被廣泛地用于分子生物學研究。受此啟發(fā)，團隊發(fā)展了一種CCPGCC標簽介導的選擇性氰基化—肼解—蛋白連接的新方法（tetracysteine enabled protein ligation, TCEPL)。
具體而言，依次加入FlAsH-EDT2和2-溴苯乙酮（PacBr）可實現(xiàn)對目標蛋白CCPGCC序列與其它Cys的正交保護，接著一鍋加入過量的1，2-乙二硫醇（EDT）以脫除FlAsH，將CCPGCC的巰基暴露。隨后加入氰基化試劑2-硝基-5-硫氰基苯甲酸（NTCB）以實現(xiàn)一鍋氰基化—肼解，獲得蛋白酰肼。待NCL完成后，一鍋加入鋅粉和3-巰基丙酸（MPA）以脫除Pac基團，即可獲得完整蛋白。整個過程僅需三步液相純化，可實現(xiàn)較大的蛋白合成收率。 何春茂教授團隊首先在模型肽段上探索實現(xiàn)了TCEPL策略，并以此完成了含53個氨基酸的鐵硫蛋白rubredoxin的半化學合成。隨后，對含207個氨基酸的基質金屬蛋白酶MMP-14進行了高效制備，并驗證了其酶催化活性。最后，團隊還將此策略應用于類泛素蛋白UBL5的C端標記，展現(xiàn)了方法優(yōu)異的多樣性和適用性?？傊?，TCEPL策略克服了當前表達蛋白連接技術的一些主要瓶頸限制，豐富了蛋白質人工合成的工具箱，為獲取序列更長的（修飾）蛋白質提供了新的技術手段。 論文信息： Protein Ligation and Labeling Enabled by a C-Terminal Tetracysteine Tag Zeyuan Mo,Shaomin Lin,Wentao Chen,Chunmao He Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202115377
