便攜化現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)診斷（point-of-care test, POCT）對(duì)于疾病早期自診自檢、降低交叉感染、控制疾病傳播和節(jié)約醫(yī)療成本至關(guān)重要。但在重大疾病、傳染病診斷及食品質(zhì)量監(jiān)督等領(lǐng)域，實(shí)用化的POCT產(chǎn)品依然嚴(yán)重匱乏。為縮短相關(guān)技術(shù)原理及裝置的研發(fā)周期，美國(guó)伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校Yi Lu教授于2011年將血糖儀作為毒品檢測(cè)的終端信號(hào)，首次提出“利用商品化POCT裝置進(jìn)行通用分子檢測(cè)”的創(chuàng)新研究思路。隨后，加拿大麥克馬斯特大學(xué)Yingfu Li教授和美國(guó)得州大學(xué)奧斯汀分校Andrew D. Ellington教授等相繼實(shí)現(xiàn)pH試紙和商品化早孕試紙（即人絨毛膜促性腺激素hCG試紙）等對(duì)核酸及非核酸物質(zhì)的精準(zhǔn)分析；證明這一創(chuàng)新思路的確是推進(jìn)通用POCT檢測(cè)的有效捷徑。然而，待測(cè)靶標(biāo)與現(xiàn)有POCT裝置之間的傳導(dǎo)方式依然存在一些實(shí)用化問(wèn)題。以早孕試紙條通用檢測(cè)為例：其高度依賴(lài)磁球分離等異相操作，步驟相對(duì)繁瑣；而操作簡(jiǎn)單的方法多為“Signal-OFF”的信號(hào)模式，易造成結(jié)果誤判。為此，需要建立更為高效和簡(jiǎn)便的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
近日，中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所李冰凌研究員和杜衍研究員合作，提出了一項(xiàng)名為“CLIPON（CRISPR and Large DNA assembly Induced Pregnancy strips for signal-ON detection）”的創(chuàng)新檢測(cè)原理；可在免分離的均相溶液中實(shí)現(xiàn)商品化早孕試紙對(duì)單鏈和雙鏈核酸序列的“Signal-ON”可視化檢測(cè)，靈敏度高、選擇性強(qiáng)、通用性強(qiáng)，并具有高度靈活的可拓展性和集成性。通過(guò)設(shè)計(jì)專(zhuān)屬的圖象處理APP和微流控芯片，CLIPON檢測(cè)可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)定量化和便攜化。 圖1展示的是CLIPON的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)原理，由四個(gè)重要的成分組成，分別是：?jiǎn)捂淒NA-hCG復(fù)合探針（NHP）、CRISPR-Cas12a、crRNA和類(lèi)花椰菜結(jié)構(gòu)的大尺寸核酸基底(CLD)。檢測(cè)前，NHP探針與CLD上的特征序列雜交，被CLD俘獲；由于CLD的尺寸較大，無(wú)法進(jìn)入早孕試紙條（以下簡(jiǎn)稱(chēng)PTS）；因此PTS上只顯示一條紅色的“控制線(xiàn)”。當(dāng)待測(cè)序列(target)存在時(shí)，其與Cas12a-crRNA復(fù)合體中互補(bǔ)的crRNA雜交，激活Cas12a反式切割活性，使NHP中的單鏈DNA碎片化；被釋放的hCG得以進(jìn)入PTS，在試紙條上呈現(xiàn)出紅色的“檢測(cè)線(xiàn)”。 圖1. CLIPON標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)流程。 CLIPON在設(shè)計(jì)上具有以下的優(yōu)點(diǎn)： 1） CRISPR-Cas12a/crRNA系統(tǒng)除了提供高選擇性的序列識(shí)別功能，還可以實(shí)現(xiàn)從待測(cè)序列到游離hCG的“一對(duì)多”轉(zhuǎn)化，提升靈敏度和信噪比。 2） CLIPON首次選用了環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）的擴(kuò)增產(chǎn)物作為大尺寸基底材料（CLD）。相比于其他常用的基底材料（磁球、核酸納米花等），LAMP產(chǎn)物具有產(chǎn)率高、免處理、尺寸大、分散性好、探針雜交位點(diǎn)多等優(yōu)點(diǎn)。 3） 僅需要更換一個(gè)crRNA組分，任意CLIPON體系（NHP, CLD和cas12a）即可用于新序列的精準(zhǔn)檢測(cè)；降低研發(fā)的周期和風(fēng)險(xiǎn)。 圖2. RPA-CLIPON用于HPV臨床樣本和RT-RPA-CLIPON用于 SARS-CoV-2假病毒檢測(cè)。 圖3. Duplex Switch-CLIPON用于基于核酸適配體的小分子腺苷檢測(cè)。 此外，CLIPON還具有較強(qiáng)的功能延展性。例如，上游與重組酶核酸擴(kuò)增（RPA或RT-RPA）對(duì)接，CLIPON可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA和RNA病原體的超靈敏分析，檢測(cè)限低至單拷貝/反應(yīng)。圖2展示的是人乳頭瘤病毒(HPV-16)和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）實(shí)際樣本的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)限低至單拷貝/微升。與核酸適配體開(kāi)關(guān)（Duplex Switch）對(duì)接，CLIPON的待測(cè)物還可以拓展至小分子等非核酸物質(zhì)。圖3展示的是小分子腺苷的檢測(cè)結(jié)果。值得注意的是，核酸適配體開(kāi)關(guān)在設(shè)計(jì)上進(jìn)一步強(qiáng)化了crRNA的通用性，即針對(duì)不同的待測(cè)分子，僅需要改變紅色字體的適配體序列即可。 綜上，CLIPON為發(fā)展通用POCT檢測(cè)提供了一個(gè)“靈敏、均相、通用和靈活”的創(chuàng)新策略。雖然如此，其整體性能還有較大的優(yōu)化和改進(jìn)空間：例如，從“分步”到“一步”的流程簡(jiǎn)化、圖像處理功能優(yōu)化、與上游恒溫?cái)U(kuò)增體系的進(jìn)一步集成等。 論文信息： CLIPON: A CRISPR-Enabled Strategy that Turns Commercial Pregnancy Test Strips into General Point-of-Need Test Devices Yidan Tang,Lijuan Qi,Yichen Liu,Lulu Guo,Rujian Zhao,Meiting Yang,Yan Du,Bingling Li 文章的第一作者是中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)化所助理研究員唐藝丹博士。 Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202115907 
