論文DOI：10.1002/adfm.202111148
本文作者構(gòu)建了一種級(jí)聯(lián)催化釋放NO抗細(xì)菌生物膜的納米反應(yīng)器，基于生物膜中的pH進(jìn)行自激活響應(yīng)，通過(guò)多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，調(diào)高生物膜中的H2O2水平，從而為NO釋放提供了條件。細(xì)菌感染作為世界上最嚴(yán)重的健康問(wèn)題之一，由于其高發(fā)病率和高死亡率，引起了人們的廣泛關(guān)注。更糟糕的是，細(xì)菌會(huì)粘附在生命體（如外科創(chuàng)面、鼻腔、泌尿道黏膜、肺組織或心內(nèi)膜）和非生命體（如醫(yī)療設(shè)備、骨科內(nèi)置物、內(nèi)鏡表面以及牙科陶瓷等）表面，進(jìn)而繁殖、分化，并分泌一些多糖基質(zhì)并將菌體群落包裹其中，最終形成生物膜。細(xì)菌一旦在傷口表面定植并形成生物膜，便可抵御宿主免疫系統(tǒng)的攻擊和抗生素在生物被膜中的滲透，使細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受性提高10-1000倍。從而引起臨床上持續(xù)性的慢性感染等各種問(wèn)題，這也是導(dǎo)致細(xì)菌性疾病難以根治的主要原因，對(duì)于一些囊性纖維化、癌癥、燒傷等病患，細(xì)菌生物膜感染甚至可能帶來(lái)致命威脅。一氧化氮（NO），作為明星信使分子，可以參與許多生理和病理活動(dòng)特別是在抗細(xì)菌感染治療領(lǐng)域，NO具有廣譜抗菌活性，在生理過(guò)程中調(diào)節(jié)多種功能，已被證實(shí)能抑制生物膜的擴(kuò)散以及觸發(fā)免疫系統(tǒng)對(duì)感染的反應(yīng)。但如何將NO氣體按需、定點(diǎn)精準(zhǔn)輸送到細(xì)菌生物膜中，是科研人員關(guān)注以及亟需解決的科學(xué)問(wèn)題。雖然胍基可在一氧化氮合成酶或H2O2存在的情況下，生產(chǎn)氣體NO，但免疫細(xì)胞只能向細(xì)菌生物膜釋放少量的H2O2，生物膜內(nèi)低濃度H2O2，不能快速有效地刺激載藥系統(tǒng)使其釋放活性藥物NO。因此選擇性地提高生物膜內(nèi)的H2O2水平，從而為抗生物膜活性藥物提供釋放條件一直存在巨大挑戰(zhàn)。基于以上研究現(xiàn)狀及面臨的問(wèn)題，蘭州大學(xué)趙光輝團(tuán)隊(duì)設(shè)想是否能選擇性地提高生物膜內(nèi)的H2O2水平，從而為抗生物膜活性藥物提供釋放條件？為此，他們?cè)O(shè)計(jì)出了一種酶級(jí)聯(lián)催化釋放NO抗細(xì)菌生物膜的自激活納米反應(yīng)器。該納米反應(yīng)器由二茂鐵/保護(hù)麥芽七糖 (Fc-AcMH) 和L-精氨酸修飾的β-環(huán)糊精 (Arg-CD) 兩部分通過(guò)二茂鐵和環(huán)糊精空腔主客體相互作用制備得到。此外，加入糖化酶（GA）和葡萄糖氧化酶（GOx）為酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)提供了可能。所設(shè)計(jì)的前藥納米顆粒Arg-CD-AcMH+GOx/GA的“自激活級(jí)聯(lián)抗生物膜”過(guò)程如下：前藥納米顆粒進(jìn)入生物膜→生物膜中的弱酸環(huán)境觸發(fā)→麥芽七糖被釋放→糖化酶和葡萄糖氧化酶依次催化→生物膜中產(chǎn)生H2O2→H2O2氧化精氨酸的胍基產(chǎn)生NO→生物膜損傷和細(xì)菌凋亡。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)表于Adv. Funct. Mater.（DOI: 10.1002/adfm.202111148），共同第一作者為蘭州大學(xué)的師玉婷同學(xué)、曹宇菲同學(xué)和程菊老師，通訊作者為趙光輝副教授。如圖1所示，當(dāng)前藥納米顆粒到達(dá)細(xì)菌生物膜后，通過(guò)水合通道滲透到生物膜中，在生物膜的弱酸性(pH≈5-6)條件下，保護(hù)麥芽七糖縮醛鍵斷裂釋放麥芽七糖。釋放的麥芽糖七糖被糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖進(jìn)一步被葡萄糖氧化酶催化產(chǎn)生大量H2O2，H2O2氧化精氨酸中的胍基產(chǎn)生NO，誘導(dǎo)細(xì)菌生物膜破裂，細(xì)菌凋亡。▲圖1：Arg-CD-AcMH+GOx/GA納米反應(yīng)器的制備及作用原理示意圖
為了驗(yàn)證這個(gè)想法，作者分別檢測(cè)了葡萄糖、H2O2和NO在體外的生成：用血糖儀監(jiān)測(cè)不同pH條件下葡萄糖的釋放，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pH 7.4條件下的累積葡萄糖釋放量相比，Arg-CD-AcMH+GOx/GA在pH 5.0條件下，累積葡萄糖釋放量在1小時(shí)后顯著增加，表明弱酸性條件確實(shí)能促進(jìn)Arg-CD-AcMH+GOx/GA中縮醛鍵水解，并進(jìn)一步在糖化酶作用下選擇性地釋放葡萄糖；通過(guò)過(guò)氧化氫試劑盒檢測(cè)了不同pH條件下H2O2的釋放，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH 5.5時(shí)H2O2累計(jì)釋放量是pH 7.4時(shí)的三倍，說(shuō)明自供給葡萄糖在很大程度上能選擇性地提高生物膜內(nèi)H2O2水平，進(jìn)一步為胍基的氧化提供了有利的條件；最后通過(guò)Griess法檢測(cè)了NO的釋放，2 h內(nèi)在pH 5.5時(shí)NO的最大生成量比pH 7.4時(shí)提高了3倍，說(shuō)明NO的釋放是可控的。▲圖2：不同pH條件下，NO、H2O2和葡萄糖的體外釋放
弱酸環(huán)境可以誘發(fā)納米反應(yīng)器生成NO殺死細(xì)菌，在不同pH條件下，研究了Arg-CD-AcMH和Arg-CD-AcMH+GOx/GA兩種材料對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生物膜的抗菌性能。生物膜的結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH 7.4時(shí)兩種材料對(duì)細(xì)菌生物膜幾乎沒(méi)有造成損傷，而pH 5.5時(shí)Arg-CD-AcMH+GOx/GA組幾乎看不到結(jié)晶紫的存在，證明Arg-CD-AcMH+GOx/GA對(duì)生物膜很好的分散作用?；钏兰?xì)菌染色也證明了pH 5.5時(shí)，Arg-CD-AcMH+GOx/GA具有良好的抗生物膜性能。▲圖3：Arg-CD-AcMH+GOx/GA納米反應(yīng)器的抗生物膜性能
最后，作者進(jìn)一步建立了大鼠皮膚生物膜感染模型，評(píng)價(jià)了納米反應(yīng)器對(duì)創(chuàng)面抗菌和愈合的實(shí)際促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著治療時(shí)間的增加，與對(duì)照組相比，經(jīng)Arg-CD-AcMH+GOx/GA處理的小鼠感染創(chuàng)面逐漸形成疤痕，且愈合速度快于其他三組。定量分析結(jié)果表明，Arg-CD-AcMH+GOx/GA組感染創(chuàng)面面積在第12天下降到0.06 cm2，創(chuàng)面面積明顯小于其他三組。而且從組織學(xué)分析結(jié)果可以看出，與其他三組相比，Arg-CD-AcMH+GOx/GA組炎性細(xì)胞更少，膠原蛋白沉積明顯增多，同時(shí)Arg-CD-AcMH+GOx/GA的治療還促進(jìn)了更多新生血管生成。▲圖4：Arg-CD-AcMH+GOx/GA納米顆粒誘導(dǎo)大鼠皮膚感染傷口愈合性能
本文作者構(gòu)建了一種級(jí)聯(lián)催化釋放NO抗細(xì)菌生物膜的納米反應(yīng)器，基于生物膜中的pH進(jìn)行自激活響應(yīng)，通過(guò)GA和GOx的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，升高生物膜中H2O2水平，從而為NO釋放提供了條件。本研究拓展了抗生物膜反應(yīng)性給藥系統(tǒng)的類型，為進(jìn)一步開發(fā)新型的自激活控釋系統(tǒng)提供了理論依據(jù)和制備經(jīng)驗(yàn)。蘭州大學(xué)趙光輝副教授團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于生物醫(yī)用高分子和納米材料的設(shè)計(jì)合成，圍繞創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤的診斷治療，重點(diǎn)開展軟組織的創(chuàng)傷修復(fù)材料、止血材料以及藥物輸送研究。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202111148
