利用生物正交反應(yīng)前后分子結(jié)構(gòu)的變化與熒光分子結(jié)合可構(gòu)建新型熒光探針并通過生物正交反應(yīng)實現(xiàn)對熒光信號的調(diào)控。在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，這種生物正交探針可減少來自未反應(yīng)探針的背景信號干擾，從而實現(xiàn)在活細(xì)胞亞細(xì)胞器高分辨成像和活體示蹤。四嗪因其快速的反應(yīng)動力學(xué)和良好的熒光調(diào)控能力，成為最高效的生物正交工具之一。近紅外熒光具有自體背景熒光干擾小、穿透深度大、光毒性小等特點。但現(xiàn)有的四嗪熒光探針構(gòu)建策略大多基于能量轉(zhuǎn)移機(jī)理，然而近紅外熒光團(tuán)的S1軌道低于四嗪S1軌道，無法實現(xiàn)對近紅外熒光分子的高效淬滅與開啟。開發(fā)具有熒光高效調(diào)控能力的四嗪近紅外探針將一直是本領(lǐng)域的挑戰(zhàn)。
近日，四川大學(xué)吳昊星課題組和新加坡科技設(shè)計大學(xué)劉曉剛課題組合作，報道了一種新型四嗪近紅外熒光探針的構(gòu)建策略，并通過計算化學(xué)解釋了設(shè)計合理性，揭示了新熒光調(diào)控機(jī)制。作者團(tuán)隊通過在熒光分子的meso位引入四嗪，構(gòu)建了一系列四嗪熒光探針。該類新型探針利用光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PeT）機(jī)制，突破了原有設(shè)計策略對熒光分子波長的限制，實現(xiàn)熒光高效淬滅，與生物正交反應(yīng)后，在586–806 nm波長范圍內(nèi)熒光開啟倍數(shù)可達(dá)102–103倍。
首先，研究者對四嗪調(diào)控近紅外熒光探針的新策略提出猜想：將四嗪與經(jīng)典近紅外熒光分子(如碳羅丹明、硅羅丹明、花菁素等)的meso位用叔胺基相連，一方面大大縮短了四嗪與熒光團(tuán)的距離，有利于兩者強(qiáng)烈的電子相互作用的發(fā)生，激活了PeT過程；另一方面，叔氨基相較于仲氨基而言可以防止熒光發(fā)射藍(lán)移，提高PeT的效率，從而提高熒光開啟比。由于PeT不需要熒光團(tuán)和四嗪的吸收光譜重疊，研究者利用此設(shè)計打破了之前策略中高效調(diào)控能力的波長限制。（圖一）
圖一 四嗪調(diào)控近紅外熒光探針的新策略 基于以上策略，研究者模塊化地合成獲得了氧羅丹明、碳羅丹明、硅羅丹明及花菁染料Cy7的meso位修飾的四嗪熒光探針。該系列探針與生物正交親二烯體反應(yīng)后，在586–806 nm波長范圍內(nèi)熒光開啟倍數(shù)可達(dá)100–1459倍。其中，花菁類探針(λem = 806 nm) 與BCN反應(yīng)后的熒光開啟比為100倍，比先前的研究高出兩個數(shù)量級。（圖二） 隨后，作者通過密度泛函理論計算進(jìn)一步解釋了熒光淬滅機(jī)制：對于λem＞700nm的探針，其激發(fā)態(tài)能級S1低于四嗪的S1能級，故能量不會轉(zhuǎn)移到四嗪的暗態(tài)。能量轉(zhuǎn)移暗態(tài)致淬滅（ETDS）理論不再適用，但由于四嗪和熒光團(tuán)的距離近，觸發(fā)了電子轉(zhuǎn)移過程：熒光團(tuán)為電子供體，四嗪為電子受體，通過PeT過程實現(xiàn)淬滅。當(dāng)四嗪與親二烯體反應(yīng)后，所產(chǎn)生的噠嗪結(jié)構(gòu)中斷了PeT過程，熒光恢復(fù)。但對于λem＜700nm的探針，其激發(fā)態(tài)能級S1接近或高于四嗪的S1能級，ETDS理論仍適用，在ETDS和PeT的共同作用下實現(xiàn)熒光淬滅。 圖二 新骨架探針的合成路線及光學(xué)性能 研究者在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，這類探針有較高的化學(xué)穩(wěn)定性且光穩(wěn)定性優(yōu)于部分商品化熒光探針。研究者利用該探針的優(yōu)良特性，成功實現(xiàn)了活細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的免洗生物成像、活鼠卵巢癌移植瘤成像，均具有優(yōu)異的分辨率和信噪比。（圖三） 圖三 免沖洗活細(xì)胞、活鼠成像 該工作將四嗪調(diào)控?zé)晒馊玖系牟ㄩL范圍拓展到了近紅外800nm區(qū)域，將進(jìn)一步促進(jìn)四嗪生物正交熒光探針在分子影像學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。 論文信息： Overcoming the Spectral Dependence: A General Strategy for Developing Far-Red and Near-Infrared Ultra-Fluorogenic Tetrazine Bioorthogonal Probes Wuyu Mao, Weijie Chi, Xinyu He, Chao Wang, Xueyi Wang, Haojie Yang, Xiaogang Liu, Haoxing Wu 第一作者為四川大學(xué)毛梧宇博士和新加坡科技設(shè)計大學(xué)遲偉杰博士。 Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202117386
