第一作者：Shizheng Wang
通訊作者：高學(xué)云，任曉君
通訊單位：北京工業(yè)大學(xué)
研究?jī)?nèi)容：
個(gè)體細(xì)胞間RNA剪接變異的差異表達(dá)解釋了細(xì)胞基因表達(dá)的異質(zhì)性，在免疫系統(tǒng)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。然而，目前的技術(shù)在實(shí)現(xiàn)RNA剪接變體的高堿基分辨率、高空間分辨率和精確定量的單細(xì)胞分析方面存在困難。該研究構(gòu)建了DNA模板雙功能納米團(tuán)簇探針，以實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平上的RNA剪接變異的原位成像和精確定量。通過(guò)設(shè)計(jì)超小納米團(tuán)簇標(biāo)記探針直接靶向RNA剪接變體的剪接點(diǎn)序列，顯著提高了堿基識(shí)別分辨率。受益于納米團(tuán)簇的可控?zé)晒猓瑢?shí)現(xiàn)了 RNA 剪接變體的原位成像和基因分型。由于原子精確的納米簇，RNA 剪接變體可以通過(guò)激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜法在單細(xì)胞水平上準(zhǔn)確量化。研究者進(jìn)一步應(yīng)用探針探索免疫激活下單核巨噬細(xì)胞中 MyD88 剪接變體的功能。該策略為研究免疫系統(tǒng)功能多樣性和剪接相關(guān)免疫疾病提供了一種新的單細(xì)胞分析工具。
示意圖1: 用于剪接變異分析的EJNC探針概述
該研究開(kāi)發(fā)了雙功能 DNA 模板化納米團(tuán)簇探針，可用于在單細(xì)胞水平上輕松分析 RNA 剪接變體。改探針有以下特點(diǎn)：
(1) 利用納米團(tuán)簇探針空間位阻小、直接靶向RNA剪接位點(diǎn)的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了RNA剪接變異體的高堿基識(shí)別分辨率。
(2) 基于納米團(tuán)簇探針的可控?zé)晒夂筒煌饘僭?，?shí)現(xiàn)了RNA剪接變異體的原位成像和基因分型。
(3) 由于原子精確的納米團(tuán)簇，通過(guò) LA-ICP-MS 對(duì) Au 或 Ag 進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以在單細(xì)胞水平上準(zhǔn)確定量 RNA 剪接變體。
此外，這些探針還用于分析免疫激活下單核巨噬細(xì)胞的 RNA 剪接變體。研究發(fā)現(xiàn)MyD88S和MyD88L都增加了。此外，還發(fā)現(xiàn)MyD88S和MyD88L的單細(xì)胞相關(guān)系數(shù)在LPS刺激下增加，這是以前基于細(xì)胞群體的技術(shù)沒(méi)有觀察到的。實(shí)際上，該方法也有局限性，檢測(cè)吞吐量受金屬元素類型的限制，忽略了亞細(xì)胞信息。未來(lái)，可以通過(guò)標(biāo)記鑭系金屬元素來(lái)提高該策略的多路復(fù)用能力。此外，不同的金屬標(biāo)記探針可以與原位RCA和DNA編碼相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了RNA剪接變體在單分子水平上的高通量成像，從而在提高產(chǎn)量的同時(shí)獲得亞細(xì)胞空間信息。然而，改方法可以用于研究細(xì)胞間的變異，并有望解釋免疫功能的多樣性和確定疾病背后的因果機(jī)制。
圖1：EJNC探頭的設(shè)計(jì)。(A) Au-EJNC和Ag-EJNC探針設(shè)計(jì)合成示意圖。(B)不同DNA序列合成Ag-EJNC的熒光光譜。(C)不同DNA序列合成的Au-EJNC探針的熒光光譜。
圖2：EJNC 探針的表征。(A) Au-EJNC (紅線) 和 Ag-EJNC (綠線) 探針的熒光和紫外可見(jiàn)吸收光譜。Au-EJNC 和 Ag-EJNC 探針在可見(jiàn)光（左）和 365 nm 便攜式紫外燈（右）下的數(shù)字照片。HP-MyD88L和 MyD88S的 DNA 序列用作對(duì)照（黑線）。(B) 游離 DNA 序列 HP-MyD88L（左）和 Au-EJNC 探針（右）的 MALDI-TOF-MS 光譜。(C) 游離 DNA 序列 MyD88S（左）和 Ag-EJNC 探針（右）的 MALDI-TOF-MS 光譜。
圖3: 利用EJNC探針對(duì)MyD88剪接變體進(jìn)行原位成像。(A和C) 通過(guò)Au-EJNC(紅色)和Ag-EJNC(綠色)探針在未處理和LPS處理的RAW264.7細(xì)胞中觀察MyD88L和MyD88S的熒光圖像。(B和D) FISH探針檢測(cè)MyD88L和MyD88S在未處理和LPS處理RAW264.7細(xì)胞中的熒光圖像。MyD88L的 FISH 探針用 Cy5 標(biāo)記，MyD88S的 FISH 探針用 Alexa488 標(biāo)記。(E) EJNC 探針在阻斷目標(biāo)位點(diǎn)后對(duì) MyD88L和 MyD88S 的熒光圖像。(F) 對(duì)照組（沒(méi)有 EJNC 探針）。
圖4：通過(guò) EJNC 探針對(duì) MyD88 剪接變體進(jìn)行單細(xì)胞定量。(A) 由 LA-ICP-MS 測(cè)定的不同濃度 (1-25 μM) Au-EJNC 和 Ag-EJNC 探針的單個(gè) RAW264.7 細(xì)胞的瞬態(tài) Au 和 Ag 信號(hào)。(B) LA-ICP-MS 對(duì) Au 和 Ag 標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線。插圖：通過(guò)噴墨打印獲得的標(biāo)準(zhǔn)。(C) 單個(gè)細(xì)胞中Au和Ag質(zhì)量的濃度優(yōu)化曲線來(lái)自圖A中Au和 Ag 信號(hào)的統(tǒng)計(jì)分布。(D)同時(shí)標(biāo)記與單獨(dú)標(biāo)記結(jié)果的比較得出 R2 = 0.99，斜率為 0.989。
圖5：分析LPS刺激后不同變體之間的表達(dá)協(xié)變。(A)未經(jīng)處理（左）和LPS處理的 RAW264.7 細(xì)胞（右）的瞬態(tài) Au 和 Ag 信號(hào)。(B) LPS刺激下細(xì)胞內(nèi)TLR信號(hào)的可變剪接和調(diào)節(jié)示意圖。(C)未經(jīng)處理和經(jīng)LPS處理的RAW264.7細(xì)胞上Au和Ag質(zhì)量的箱線圖。Au質(zhì)量代表MyD88L的表達(dá)，Ag質(zhì)量代表MyD88S的表達(dá)。***表示兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，***p < 0.001。(D) RT-qPCR 刺激前后 MyD88L和 MyD88S變體在 RAW264.7 細(xì)胞上的定量平均表達(dá)，***p < 0.001。
參考文獻(xiàn)
Shizheng Wang, Xiaochen Ma, Zifu Yang, Xiangchun Zhang, Xiaolei Chen, Yuqing Xia, Xueyun Gao,*and Xiaojun Ren*. Dual-Functional Nanocluster Probe-Based Single-Cell Analysis of RNA Splice Variants. Anal. Chem. 2022. DOI: 10.1021/acs.analchem.1c04918
