通訊單位：美國德克薩斯大學奧斯汀分校、西北農(nóng)林科技大學、中科院深圳先進技術研究院、中科院上海有機化學研究所、中國醫(yī)學科學院藥物研究所、廈門大學、北京中醫(yī)藥大學https://doi.org/10.1021/jacs.1c12010 在早期研究中，BlsE被認為是唯一已知的催化非氧化脫羧反應的自由基SAM酶。然而，美國德克薩斯大學奧斯汀分校劉鴻文教授研究團隊對BlsE功能的重新表征發(fā)現(xiàn)，該酶實際上催化底物CGA的1,2-二醇脫水反應，該發(fā)現(xiàn)使得BlsE在殺稻瘟菌素S（Blasticidin S，BLS）生物合成中的角色更加明朗；同時，該研究結合化學生物學、結構生物學和理論計算研究詳細揭示了BlsE催化脫水反應的分子機制。研究表明BlsE催化CGA發(fā)生脫水反應是通過分子內(nèi)的質子傳遞產(chǎn)生4'-碳負離子進而脫去3'-羥基而完成的。該研究成果近日在線發(fā)表于《Journal of the American Chemical Society》上（https://doi.org/10.1021/jacs.1c12010），劉鴻文教授課題組的博士研究生李渝萱、中科院深圳先進技術研究院/中科院上海有機所周佳海教授課題組，來自西北農(nóng)林科技大學/中科院上海有機所的博士研究生候雪麗、劉鴻文教授課題組訪問學者/中國醫(yī)學科學院藥物研究所的陳日道博士為該文的共同第一作者，此外，廈門大學王斌舉教授的團隊，西北農(nóng)林科技大學高錦明教授，和北京中醫(yī)藥大學等單位的研究人員也共同參與了該項研究工作。自由基SAM酶（Radical SAM enzymes）是一類利用鐵硫簇與S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）催化自由基轉化的金屬酶，目前該酶家族已經(jīng)有超過50萬個成員。在已被解析的天然產(chǎn)物生物合成途徑中，許多復雜的反應均依賴于自由基SAM酶的催化，該類酶通過四鐵四硫簇還原SAM使其5'碳-硫鍵均裂，進而產(chǎn)生高度活潑的5'-脫氧腺苷自由基（5'-dAdo·），該自由基可通過拔取底物上的氫原子生成底物自由基，從而引發(fā)包含烷基化、脫水、差向異構化或重排等多樣的化學反應。BlsE：自由基SAM脫羧酶中的特例？生物合成中的真實角色？BlsE是BLS生物合成的關鍵酶之一，遺傳敲除BLS生產(chǎn)菌基因組中該酶的編碼基因會導致生物合成中間體CGA的累積。早期文獻報道顯示BlsE催化CGA結構中5'碳的中性脫羧反應生成CAP，然而該研究結果與BLS分子結構中仍保留有5'羧基的事實相悖。另一方面，盡管脫羧反應是自由基SAM酶催化的常見反應之一，但主要為氧化脫羧反應，即底物自由基在脫羧過程中經(jīng)歷單電子氧化達到淬滅，BlsE催化中性脫羧的行為顯得極其罕見。為了探究BlsE是否是自由基SAM脫羧酶中的特例，劉鴻文教授課題組決定對該酶功能進行重新表征。劉教授課題組經(jīng)過細致的研究分析發(fā)現(xiàn)，BlsE催化CGA生成的反應產(chǎn)物雖然顯示出與CAP分子量相符合的質譜信號，但其NMR光譜數(shù)據(jù)表明該產(chǎn)物的真實結構是底物CGA發(fā)生脫水和脫羧反應后生成的化合物PPN。根據(jù)化學結構分析該產(chǎn)物的形成過程可能包含3'-羥基的離去以及4'-羰基的產(chǎn)生，雖然3', 4'-脫水反應常見于糖類化合物的生物合成，但這一轉化將使CGA形成不穩(wěn)定的β-酮酸結構（Pdt），因此，他們推測5'-脫羧可能是發(fā)生在酶催化脫水后的非酶促催化反應。為了驗證該推測，作者通過提高反應中BlsE的濃度并縮短反應時間來累積BlsE的直接催化產(chǎn)物。在此反應條件下，他們觀測到一個新產(chǎn)物的生成，該產(chǎn)物隨時間延長降解為PPN，或可以被硼氫化鈉還原生成CGA的3'-脫氧產(chǎn)物，從而證明了BlsE的催化產(chǎn)物是CGA脫水后的β-酮酸結構（Pdt）。換言之，BlsE并非催化CGA的非氧化脫羧反應，而是催化該化合物發(fā)生脫水反應。BlsE催化的脫水反應類似于劉鴻文教授課題組早期發(fā)現(xiàn)與表征的另外兩個自由基SAM裂合酶：DesII和AprD4所催化的反應。他們因此推測BlsE的催化可能始于5'-脫氧腺苷自由基拔取底物上的4'-氫原子來形成底物自由基 (23)，而底物自由基可以通過以下兩種機制達成脫水：（a）3'-羥基的1,2-遷移或（b）形成4'-碳負離子來脫去3'-羥基。為了驗證這些假設，作者通過化學合成得到一系列同位素標記的CGA底物。通過質譜分析發(fā)現(xiàn)，以4'D-CGA為底物時可以在BlsE反應中檢測到氘代-5'-脫氧腺苷的生成，從而驗證了催化機制第一步對于拔氫原子區(qū)域選擇性的假設。接著，他們以[3'-18O]-CGA為底物，觀察到3'-羥基在BlsE催化中被離去，進而否定了3'-羥基遷移的假設（機制a）。由于氟原子與羥基大小類似，也可作為離去基團，但化學性質上更為缺電子且不能被去質子化，因此，氟代底物類似物常被用于酶催化分子機制的研究。劉教授課題組發(fā)現(xiàn)BlsE可以脫去3'-氟代CGA的氟，但不能離去4'-氟代CGA的氟。以上實驗結果不僅支持機制b中描述的3'-羥基脫去，更顯示CGA中4'-羥基可能提供質子以中和離去3'-羥基的強堿性。通過廈門大學王斌舉教授課題組所進行的分子動力學（MD）模擬發(fā)現(xiàn)，機制b的活化能遠低于a且與高活性5'-脫氧腺苷自由基的能量匹配，進一步支持了機制b的合理性。為了深入揭示BlsE催化的分子機制，劉教授課題組與中科院深圳先進技術研究院/中科院上海有機所周佳海教授課題組合作解析了BlsE的蛋白質晶體結構。結果顯示BlsE的N末端為自由基SAM酶中常見的用以結合鐵硫簇以及SAM的TIM桶狀結構，而其C末端則為用以結合輔助簇的twitch結構域，表明BlsE與功能相近的AprD4在結構上并不相似。通過比較BlsE-SAM與BlsE-SAM-CGA共晶的三維結構，他們發(fā)現(xiàn)底物CGA的結合使BlsE由開放的構象轉變?yōu)殚]合的構象，推測主要由CGA中的5'-羧基的作用引起。此外，晶體結構分析顯示底物CGA與活性位點中的數(shù)個親水殘基可能存在氫鍵作用，作者進一步通過定點突變實驗驗證了這些殘基對保持BlsE催化活性的關鍵作用。然而，活性位點殘基中并不包含明顯的堿性殘基，他們因此推測機制b中的碳負離子是通過4'-羥基與3'-羥基之間的分子內(nèi)質子轉移而非堿性蛋白殘基對4'-羥基的去質子化而形成（機制c）。另外值得一提的是，BlsE為自由基SAM酶超家族中首個被表征的twitch家族裂合酶。在該研究中，劉鴻文教授研究團隊對BlsE的功能進行了再表征，發(fā)現(xiàn)該酶實際上催化底物CGA的1,2-二醇脫水反應，修正了之前人們對BlsE功能的認知。作者與周佳海、王斌舉、高錦明合作，結合化學生物學、結構生物學和理論計算的系統(tǒng)研究，深入揭示了BlsE催化反應的分子機制。該研究表明BlsE催化CGA發(fā)生脫水反應是通過分子內(nèi)的質子傳遞產(chǎn)生4'-碳負離子進而脫去3'-羥基而完成的，而由于所生成的β-酮酸產(chǎn)物的不穩(wěn)定性，該產(chǎn)物容易進一步發(fā)生非酶促催化的脫羧反應，這一發(fā)現(xiàn)解釋了早期文獻報道中觀察到脫羧反應的原因。雖然BlsE催化生成的β-酮酸產(chǎn)物并不穩(wěn)定，但此中間體可能在生物體內(nèi)有效地被下游的生物合成酶所利用，從而完成BLS的生物合成，該推測的驗證還有待開展進一步的深入研究。劉鴻文（Hung-wen Liu）教授，為美國德克薩斯大學奧斯汀分校（University of Texas at Austin）藥學院化學生物學和藥物化學系以及自然科學學院化學系教授。劉教授團隊的研究興趣在于化學和生物學交叉學科的重要科學問題，近年來主要致力于闡明重要天然產(chǎn)物生物合成酶的催化機制，包括生物合成中涉及的自由基轉化與碳-碳鍵生成的詳細機制。其團隊在國際著名學術雜志Nature、Science、J. Am. Chem. Soc.、Chem. Review、Angew. Chem. Int. Ed.發(fā)表了多項具有重要影響力的研究成果。代表性成果包括，（1）解析了臨床上應用的重要抗生素磷霉素（fosfomycin）的生物合成機制（Nature 2005, 437, 838）；（2）系統(tǒng)闡明了天然產(chǎn)物分子中不種類型的糖基單元的生物合成（Nature 2007, 446, 1008）；（3）發(fā)現(xiàn)了自然界中首個在體外單獨催化[4+2]環(huán)加成反應的參與多殺菌素A（spinosyn A）生物合成的環(huán)化酶，解析了其蛋白結構并闡明了其催化[4+2]環(huán)加成反應的分子機制（Nature 2011, 473, 109； Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 256）。劉鴻文教授曾擔任美國化學學會期刊Organic Letter副主編，并獲頒中央研究院院士、美國微生物學會、美國先進科學學會、美國化學學會與日本科學促進會會士，以及Claude D. Hudson Award、Repligen Award、Horace S. Isbell Award、Nakanishi Prize、Arthur C. Cope Scholars Award、Norman R. Farnsworth Award, 等學術獎項以表彰其在醣化學、生物化學與有機化學研究領域所做出的貢獻。(https://sites.utexas.edu/liu/)https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c12010
