RNA剪接是將Pre-mRNA中的內(nèi)含子移除同時將外顯子連接形成成熟mRNA的過程，是真核細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。基因突變導(dǎo)致的剪接異常如外顯子跳躍和內(nèi)含子保留，會引起蛋白質(zhì)的缺失或功能異常，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。RNA剪接調(diào)節(jié)劑可通過糾正異常剪接恢復(fù)突變基因的功能。以Risdipalm和Branaplam為代表的小分子剪接調(diào)節(jié)劑以其可直接作用于pre-mRNA的新機(jī)制獲得了極大的關(guān)注。目前，小分子剪接調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)主要通過表型篩選發(fā)現(xiàn)苗頭化合物。熒光報告基因?qū)嶒灒∕inigene reporter assay）是常用的高通量篩選方法（圖1）。該方法將目標(biāo)外顯子及其相鄰的序列構(gòu)建到報告質(zhì)粒中，通過檢測熒光素酶活性確定目標(biāo)外顯子的剪接模式和小分子的剪接調(diào)節(jié)活性。然而，該方法中的目標(biāo)外顯子脫離了自然的基因序列環(huán)境，忽略了潛在的順式作用元件的功能。
圖1 近日，研究人員開發(fā)了一種酶片段互補(bǔ)分析實驗用于篩選小分子剪接調(diào)節(jié)劑，該方法可以保留整個目標(biāo)基因的序列，使其更接近自然情況下的剪接過程（圖2）。作者利用CRISPR巧妙地將一段小的β-半乳糖苷酶蛋白標(biāo)簽插入到目的基因中，該標(biāo)簽蛋白可與另一片段組合成完整的β-半乳糖苷酶。當(dāng)異常剪接導(dǎo)致含有該標(biāo)簽的表達(dá)產(chǎn)物不能穩(wěn)定存在時，則不表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性。從而將剪接模式與目標(biāo)基因剪接亞型產(chǎn)物的穩(wěn)定性關(guān)聯(lián)起來。 圖2 作為概念驗證，作者構(gòu)建了一個檢測SMN2基因7號外顯子（exon 7）剪接模式的模型。在脊髓性肌肉萎縮癥（SMA）患者中， SMN1因突變喪失編碼SMN蛋白的功能，而SMN2則由于異常剪接導(dǎo)致超過80%產(chǎn)物缺失7號外顯子，該異常蛋白產(chǎn)物因穩(wěn)定性差被快速降解。作者在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中，通過CRISPR/cas9使用SMN1特異性的sgRNA成功對SMN1進(jìn)行敲除，建立了SMA表型。之后在發(fā)現(xiàn)蛋白標(biāo)簽在氮端的活性更高時，利用CRISPR/cas9將編碼標(biāo)簽蛋白的基因插入到SMN2的5’端，成功構(gòu)建了細(xì)胞篩選模型（圖3A）。作者隨后優(yōu)化了實驗條件使其適用于高通量篩選并使用已知的SMN2剪接調(diào)節(jié)劑驗證了方法的可行性 （圖3B, C）。作者同樣對比了該EFC實驗與熒光報告基因?qū)嶒灪蛍estern blots實驗用于檢測剪接亞型產(chǎn)物的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)EFC實驗與熒光報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果更相似，而western blots實驗更靈敏。 圖3 需要指出的是，該方法依賴于剪接亞型產(chǎn)物的穩(wěn)定性差異，如缺少7號外顯子 的SMN蛋白易降解而不能穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)簽蛋白。不過，如果可以在目標(biāo)基因的其中一個剪接亞型中引入移碼突變來造成蛋白產(chǎn)物穩(wěn)定性差異，那么該方法也同樣適用。 論文信息 CRISPR-Mediated Enzyme Fragment Complementation Assay for Quantification of the Stability of Splice Isoforms Dr. Zhichao Tang,Shalakha Hegde,Dr. Junxing Zhao,Dr. Shoutian Zhu, Dr. Kristen A. Johnson, Prof. Christian L. Lorson, Prof. Jingxin Wang ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202200012
