在制藥工業(yè)中，手性純氨基酸發(fā)揮著重要的作用。其中，L-苯甘氨酸可用于合成β-內(nèi)酰胺類抗生素，如青霉素。此類抗生素具有殺菌活性強(qiáng)、毒性低、適應(yīng)癥廣及臨床療效好的優(yōu)點(diǎn)。目前已有許多化學(xué)合成路線開發(fā)用于生產(chǎn)對映體純氨基酸。例如，Strecker 反應(yīng)是工業(yè)化生產(chǎn)α-氨基酸的常用方法。然而，化學(xué)方法通常使用對環(huán)境有害的有毒試劑和有機(jī)溶劑，并且產(chǎn)品的對映選擇性相對較低，這對于可持續(xù)生產(chǎn)對映體純氨基酸并不有利。與化學(xué)方法相比，生物催化方法通常在溫和反應(yīng)條件下進(jìn)行，且因其優(yōu)良的對映選擇性被認(rèn)為是手性化合物生產(chǎn)的有效途徑。
為了實(shí)現(xiàn)從L-苯丙氨酸綠色可持續(xù)生產(chǎn)高價(jià)值手性氨基酸L-苯甘氨酸，本文作者首先設(shè)計(jì)了以大腸桿菌內(nèi)源轉(zhuǎn)氨酶（AT）依賴的多酶級聯(lián)路徑（圖 1）進(jìn)行生產(chǎn)。
圖 1. 從L-苯丙氨酸合成L-苯甘氨酸的多酶級聯(lián)示意圖 如圖2a所示，多酶級聯(lián)被重新構(gòu)建為三個(gè)模塊，對含有三種質(zhì)粒的重組大腸桿菌菌株Ec-Phg1.0進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖2b），對實(shí)驗(yàn)pH條件進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)L-苯甘氨酸合成的理想pH值約為8.0（圖2c）。如圖2d所示，將10 mM L-苯丙氨酸投喂表達(dá)五種酶的重組大腸桿菌Ec-Phg1.0，48小時(shí)后獲得7.21±0.15 mM L-苯甘氨酸，相當(dāng)于約72.1%的轉(zhuǎn)化率。根據(jù)HPLC結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)生物催化過程中積累了大量苯甲酰甲酸（BFA）（圖2e）。對BFA積累的原因進(jìn)行探索，最終作者推測LAAD對胺供體L-谷氨酸的消耗是導(dǎo)致BFA積累的重要原因。 圖2. 氨基轉(zhuǎn)移酶（AT）依賴途徑生物催化合成L-苯甘氨酸 接下來，作者重新設(shè)計(jì)構(gòu)建蠟樣芽胞桿菌亮氨酸脫氫酶（LeuDH）依賴的多酶級聯(lián)途徑用于L-苯甘氨酸的生產(chǎn)（圖 1）。如圖3a所示，作者進(jìn)一步構(gòu)建了重組大腸桿菌菌株Ec-Phg2.0，并進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖3b）。從圖3c和3d中可以看出，當(dāng)分別使用10 mM和40 mM L-苯丙氨酸作為底物時(shí)，12小時(shí)后分別產(chǎn)生9.92±0.39 mM 和39.97±3.84 mM L-苯甘氨酸，轉(zhuǎn)化率均＞99%，從液相結(jié)果可看出中間產(chǎn)物BFA的積累問題得到了解決（圖3e）。 圖3. 亮氨酸脫氫酶（LeuDH）依賴途徑生物催化合成L-苯甘氨酸 作者開發(fā)了兩條人工酶級聯(lián)路徑，從L-苯丙氨酸合成對映體純氨基酸L-苯甘氨酸。然而，第一條酶級聯(lián)路徑存在中間產(chǎn)物BFA的累積現(xiàn)象，導(dǎo)致目標(biāo)L-苯甘氨酸的產(chǎn)量偏低。接下來，作者設(shè)計(jì)了第二條酶級聯(lián)路徑，使用蠟樣芽胞桿菌的LeuDH替代AT/GluDH，成功解決了中間產(chǎn)物積累的問題，通過簡潔的四步酶級聯(lián)反應(yīng)可以有效地將40 mM L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為39.97±3.84 mM（6.04±0.58g/L）的L-苯甘氨酸，12 h轉(zhuǎn)化率>99.9%。成功實(shí)現(xiàn)從天然可再生底物L(fēng)-苯丙氨酸生物催化合成L-苯甘氨酸的最高產(chǎn)量。且催化過程中沒有明顯的中間產(chǎn)物積累，本文的生物催化方法將大大簡化產(chǎn)品分離過程，在未來的工業(yè)應(yīng)用中具有巨大的潛力。 論文信息 A Four-Step Enzymatic Cascade for Efficient Production of L-Phenylglycine from Biobased L-Phenylalanine Yuling Zhu, Dr. Jifeng Yuan ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202100661
