泛素化是真核生物所特有的一種蛋白翻譯后修飾，其參與了真核生物眾多信號通路的調(diào)節(jié)。泛素（UB）在泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的依次催化下，可以形成七種酰胺鍵連接的泛素鏈。不同連接形式的泛素鏈攜帶不同的信息，能夠被具有UB結(jié)合域（UBD）的蛋白和E1，E2，E3或去泛素化酶（DUB）特異性的識別。目前，通過合成特異連接的diUB探針來破譯由蛋白質(zhì)泛素化介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而合成具有特異連接的泛素鏈一直是一項挑戰(zhàn)。
為了解決這一問題，佐治亞州立大學(xué)尹駿教授課題組發(fā)展了一種簡單高效的特異連接diUB探針的合成方法。利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)，將化學(xué)合成的非天然氨基酸（UAA）Nε-L-thiaprolyl-L-Lys (L-ThzK)引入泛素分子的特異位點(diǎn)，再通過蛋白質(zhì)連接來實現(xiàn)特異連接的雙泛素分子探針的合成。
圖1. 特異連接雙泛素分子探針的合成，以及與E2，E3，DUB的反應(yīng) 作者首先通過UAA嵌合技術(shù)，將非天然氨基酸ThzK引入到泛素分子的特定位點(diǎn)（K11, K48 或K63）。之后通過甲基羥胺實現(xiàn)了從ThzK到半胱氨酸共軛賴氨酸（CysK）的轉(zhuǎn)化，從而完成了受體UB的制備工作。對于供體UB的制備，作者通過幾丁質(zhì)（chitin）親和層析純化UB(1-75)和內(nèi)含肽（intein）的融合蛋白，再用2-巰基乙磺酸鈉（MESNa）對內(nèi)含肽融合蛋白進(jìn)行柱上裂解，從而釋放出供體UB。之后通過化學(xué)接合法（chemical ligation）在供體UB和受體UB之間形成具有特異異肽鍵的diUB分子。 接下來作者驗證了特異連接的diUB探針的反應(yīng)活性。作者一方面以DiUB連接處的半胱氨酸殘基作為反應(yīng)手柄，與有著特異連接選擇性催化活性的E2和E3之間形成二硫鍵，實現(xiàn)了diUB與E2、E3綴合物的合成。文章中成功展示了Ube2S (C118A)的催化結(jié)構(gòu)域和K11-diUB，Huwe1 HECT結(jié)構(gòu)域的單半胱氨酸突變體和K48-diUB，以及Nedd4 HECT結(jié)構(gòu)域的單半胱氨酸突變體和K63-diUB之間的共價連接，形成了包括受體UB，供體UB和催化特異連接的E2或E3的三元綴合物。 另一方面，合成的diUB可以通過脫硫反應(yīng)得到脫氫丙氨酸（Dha），并以新形成的Michael加成受體作為另一個反應(yīng)手柄，來捕獲具有親核半胱氨酸殘基的DUB。文章中作者成功測試了Dha功能化K48-diUB探針與可以識別K48泛素鏈的DUB OTUB1, OTUB2和USP2 的反應(yīng)性。 該工作中作者成功通過UAA嵌合技術(shù)實現(xiàn)了特異連接的diUB分子探針的合成，并展示了該技術(shù)在UB綴合物合成中的巨大潛力，從而為探索泛素轉(zhuǎn)移的生化機(jī)制以及破譯細(xì)胞中蛋白質(zhì)泛素化攜帶的生物信號提供了強(qiáng)大工具。 論文信息 Linkage-Specific Synthesis of Di-ubiquitin Probes Enabled by the Incorporation of Unnatural Amino Acid ThzK Dr. Han Zhou, Tomaya Carpenter, Xuan Fu, Bo Jin, Britton Ody, Mohammad Sazid Hassan, Savannah E. Jacobs, Jenny Cheung, Eve M. Nicholson, Prof.?Dr. Mark Turlington, Prof.?Dr. Bo Zhao, Dr. Sonja Lorenz, Prof.?Dr. T. Ashton Cropp, Prof.?Dr. Jun Yin ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202200133
