對(duì)生物分子進(jìn)行選擇性的化學(xué)修飾為生物和生物醫(yī)學(xué)研究提供了重要的工具。其中，生物正交標(biāo)記反應(yīng)已經(jīng)被成功地用于序列識(shí)別、病毒感染檢測(cè)、蛋白交聯(lián)、代謝途徑的闡明和耐藥敏感機(jī)制的探討之中。目前，這種生物正交標(biāo)記主要通過(guò)以下幾種方式：銅催化或張力促進(jìn)的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)（CuAAC/SPAAC）；烯烴和四嗪之間發(fā)生的逆電子效應(yīng)Diels-Alder反應(yīng)（IEDDA）；四唑的1,3-偶極“光點(diǎn)擊”加成反應(yīng)。盡管這些方式在體外已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但它們?cè)隗w內(nèi)的表現(xiàn)卻不盡如人意，具有一定的局限性（僅限作用于RNA單鏈、具有光毒性、反應(yīng)速度慢）。針對(duì)這一問(wèn)題，來(lái)自加拿大麥吉爾大學(xué)的Nathan W. Luedtke教授課題組設(shè)計(jì)了一種針對(duì)核苷烯烴基團(tuán)的成像探針，取名為“PINK”（Probe for Imaging Nucleosidic AlKene groups）。該探針結(jié)合了熒光嵌入劑和四嗪，其中四嗪既可作為生物正交官能團(tuán)又可作為熒光猝滅劑。
圖1.PINK探針的工作示意圖 PINK本身是非熒光的，它可以通過(guò)與雙鏈DNA上的堿基發(fā)生堆積而嵌入其中，且這個(gè)過(guò)程是可逆的。通過(guò)不斷的嵌入與脫出對(duì)DNA進(jìn)行“掃描”，直到遇到乙烯基修飾的核苷酸（VdU，人為添加進(jìn)入活細(xì)胞或動(dòng)物中）后快速發(fā)生IEDDA反應(yīng)并放出熒光（圖1）。這種方法為活細(xì)胞中DNA復(fù)制提供了第一個(gè)無(wú)需洗去未結(jié)合熒光分子、只需簡(jiǎn)單混合即可檢測(cè)熒光的方法。 圖2. PINK的合成和與VdU的作用過(guò)程 首先，作者以苯胺1為起始原料，與芳基溴2進(jìn)行Buchwald Hartwig交叉偶聯(lián)反應(yīng)。所得仲胺在與Lewis酸性硅膠接觸時(shí)自發(fā)環(huán)化，得到吖啶腈3。最后將3與肼、ZnII和乙腈反應(yīng)，然后用NaNO2氧化，引入不對(duì)稱甲基四嗪得到PINK（4）。 圖3. PINK的光物理和DNA結(jié)合特性 為了評(píng)估PINK在雙鏈DNA中可逆嵌入的能力，作者監(jiān)測(cè)了加入小牛胸腺（CT）DNA后PINK的吸光度。和預(yù)期一樣，加入CT DNA后，可以觀察到PINK吸光度的紅移（圖3a）。為了進(jìn)一步評(píng)估它們的結(jié)合模式，在PINK存在的情況下，作者對(duì)不同濃度的DNA溶液進(jìn)行了粘度測(cè)量。與Lerman對(duì)DNA嵌入劑的假設(shè)一致，PINK的加入會(huì)導(dǎo)致DNA溶液粘度（η）增加，并在PINK和DNA堿基對(duì)之間表現(xiàn)出1:5的化學(xué)計(jì)量比（圖3b）。此外，通過(guò)監(jiān)測(cè)PINK隨DNA濃度增加的吸光度變化的化學(xué)計(jì)量學(xué)，作者估計(jì)其表觀解離常數(shù)（KD）= 5.1 μM（圖3a）。它表現(xiàn)出的DNA親和力與其他吖啶衍生物類似，說(shuō)明PINK中的四嗪部分不會(huì)干擾DNA結(jié)合。PINK（4）與VdU（5）能夠進(jìn)行高熒光和區(qū)域選擇性的IEDDA反應(yīng)（圖2），在二者反應(yīng)過(guò)程中，可以觀察到熒光增加了100倍（圖3c）。此外，圖3d說(shuō)明PINK-VdU反應(yīng)產(chǎn)物（6）的量子產(chǎn)率（?F）在3.5 %到19%之間，這與所使用的溶劑相關(guān)。 圖4. 活HeLa細(xì)胞的DNA代謝標(biāo)記和成像 為了評(píng)價(jià)PINK進(jìn)入活細(xì)胞并與天然染色質(zhì)中的乙烯基進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生熒光的能力，作者使用Hela細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)試。在共聚焦熒光顯微鏡下，成對(duì)的、具有亮粉色熒光的子細(xì)胞僅在VdU處理的細(xì)胞中可以看到, 并且在PINK和非共價(jià)核染色Hoechst 33342之間觀察到明顯的共定位。這些結(jié)果說(shuō)明了PINK成功實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)VdU的成像（圖4）。 圖5. VdU-PINK標(biāo)記對(duì)DNA合成的影響以及用于DNA合成和細(xì)胞分裂的追蹤 為了研究VdU-PINK標(biāo)記對(duì)后續(xù)DNA合成的潛在影響，作者用5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）進(jìn)行了pulse-chase實(shí)驗(yàn)（圖5a）。先用20 μM VdU孵育細(xì)胞16 h，接著用PINK孵育4 h。然后添加EdU 孵育4 h作為追蹤劑，通過(guò)細(xì)胞固定和銅催化炔烴與熒光疊氮化物環(huán)加成觀察DNA合成。如圖5a中展示，PINK+和EdU+雙陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)出共定位核染色。這些結(jié)果表明，PINK-VdU反應(yīng)產(chǎn)物沒(méi)有引起細(xì)胞周期阻滯。基于上述結(jié)果，文章的最后，作者使用VdU和PINK來(lái)追蹤DNA的合成和細(xì)胞分裂，成功地記錄了完整的有絲分裂周期（圖5b）。 總而言之，本文開(kāi)創(chuàng)性地通過(guò)雙重增強(qiáng)策略開(kāi)發(fā)了具有吖啶熒光劑與四嗪結(jié)構(gòu)的探針PINK。其中吖啶部分既可作為熒光探針，也可作為速度增強(qiáng)的嵌入劑；同時(shí)，四嗪部分可以作為熒光猝滅基團(tuán)和生物正交官能團(tuán)。這是第一個(gè)能夠在活細(xì)胞中與核酸共價(jià)反應(yīng)時(shí)顯示熒光增強(qiáng)的熒光嵌入劑。以往利用生物正交法對(duì)細(xì)胞內(nèi)乙烯基修飾的DNA進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記的研究都依賴于細(xì)胞固定和變性來(lái)促進(jìn)四嗪-烯烴反應(yīng)。本文的策略使得吖啶修飾的核酸在分裂細(xì)胞中的活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像成為可能。 論文信息 A Kinetic and Fluorogenic Enhancement Strategy for Labeling of Nucleic Acids Morten O. Loehr, Prof. Nathan W. Luedtke 文章的通訊作者是來(lái)自加拿大麥吉爾大學(xué)的Nathan W. Luedtke教授。Nathan W. Luedtke教授及其團(tuán)隊(duì)致力于體內(nèi)核酸代謝標(biāo)記方面的研究。 Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202112931
