在合成生物學(xué)中，科學(xué)家致力于通過(guò)對(duì)核酸進(jìn)行化學(xué)修飾從而構(gòu)建具有特定功能的可調(diào)控的復(fù)雜系統(tǒng)。在微生物和人體細(xì)胞中引入化學(xué)修飾核酸在生物技術(shù)及醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用。比利時(shí)魯汶大學(xué)的Piet Herdewijn教授課題組在先前的研究中已成功將全堿基修飾（7-deaza-adenine, 5-chlorouracil, 7-deaza-guanine，5-fluorocytosine）的DNA序列（DZA）引入大腸桿菌中。最近，他們合成了編碼酵母增強(qiáng)型紅色熒光蛋白（yeast-enhanced red fluorescent protein，yEmRFP）部分或全部修飾的長(zhǎng)DZA片段。該片段通過(guò)酵母的同源重組機(jī)制被直接引入其基因組中。這種DZA修飾方法為在酵母體內(nèi)開展異種生物學(xué)研究提供了簡(jiǎn)單且直接的克隆策略。
作者首先通過(guò)化學(xué)方法合成了四種非天然三磷酸單體（7-deazaA [A*]、5-CIU [T*]、7-deazaG [G*]和5-FC [C*]）（圖1a）。作者接下來(lái)設(shè)計(jì)了基于PCR的篩選方法，用于探究DNA聚合酶對(duì)這些核酸類似物的兼容性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)全為非天然核苷酸（dZTPs）的PCR產(chǎn)物量可達(dá)到天然核苷酸（dNTPs）的80%（圖1b）。
圖1.用于探究聚合酶對(duì)dNTPs兼容性的PCR擴(kuò)增方法。 在之前的研究中，作者證明了DZA片段攜帶的遺傳信息可在原核細(xì)胞（大腸桿菌）中精確傳遞。相比于傳統(tǒng)的基因克隆方法，酵母體內(nèi)組裝技術(shù)具有無(wú)酶消化、無(wú)體外連接、無(wú)多步純化等優(yōu)勢(shì)，因此作者選擇其作為真核細(xì)胞模型。 作者先模擬設(shè)計(jì)了三種不同的質(zhì)粒組裝。將紅色熒光蛋白基因（RFP）DNA片段與載體組裝，構(gòu)建空白對(duì)照質(zhì)粒（blank-DNA-RFP）。再將DZA RFP基因和DNA RFP基因與攜帶有GFP的載體組裝，構(gòu)建DZA-RFP-GFP和DNA-RFP-GFP。如果酵母細(xì)胞能成功識(shí)別插入的DZA或DNA片段，則選擇瓊脂平板上可檢測(cè)到綠色和紅色熒光克隆（圖2）。 圖2.天然或修飾基因片段與載體經(jīng)體內(nèi)組裝后于酵母中表達(dá)。 作者接下來(lái)以blank-DNA-RFP為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得DZA-RFP和DNA-RFP片段。作者發(fā)現(xiàn)嘧啶修飾核苷酸的擴(kuò)增效率顯著高于嘌呤修飾核苷酸（圖3a）。作者推測(cè)7-deazaG修飾低效率的實(shí)際原因是含7-deazaG的PCR產(chǎn)物不易被DNA染料染色，而并非PCR產(chǎn)物的量少。而7-deazaA修飾低效率的原因是RFP基因中AT含量過(guò)高，多個(gè)連續(xù)修飾A的插入不利于DZA片段的合成。作者還用LC/MS-MS進(jìn)一步驗(yàn)證了DZA-RFP-GFP片段中堿基的修飾（圖3b）。 圖3.DNA-和DZA-RFP-GFP基因片段的合成與核苷組成分析。 隨后，作者將blank-DNA-RFP、DNA-和DZA-RFP-GFP與線性化載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)酵母細(xì)胞中。為了排除污染，作者還設(shè)置了多個(gè)質(zhì)控步驟以確保表達(dá)蛋白的來(lái)源為合成的DNA和DZA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DZA-RFP-GFP組產(chǎn)生了黃色克隆，這表明酵母可正確的識(shí)別DZA片段并將其翻譯成功能性的熒光蛋白（圖4）。 圖4.在釀酒酵母中表達(dá)blank-DNA-RFP和DNA/DZA-RFP-GFP。 最后，作者發(fā)現(xiàn)目的基因的表達(dá)不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)（表1）。然而，當(dāng)RFP基因被A*修飾后，紅色熒光蛋白克隆比例顯著降低。作者推測(cè)既可能是因?yàn)镽FP基因中的poly-A結(jié)構(gòu)，也可能是因?yàn)?-deazaA的高突變累積導(dǎo)致了酵母死亡。作者對(duì)酵母的RFP片段進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證了猜想。 表1.在基因轉(zhuǎn)化后，釀酒酵母在兩種選擇培養(yǎng)基中的克隆生長(zhǎng)數(shù)。 綜上所述，作者在這篇文章中報(bào)道了一種在真核細(xì)胞中引入非天然核酸的方法。由7-deazaA, 5-CIU, 7-deazaG和5-FC組成的復(fù)雜長(zhǎng)片段DZA基因可用于編碼熒光蛋白。酵母細(xì)胞以同源重組的形式識(shí)別和利用這些合成DZA片段。該酵母體內(nèi)組裝方法無(wú)需額外酶參與，避免了可能的損失和污染。通過(guò)對(duì)該方法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，未來(lái)可用于糖環(huán)或骨架修飾的其他非天然核酸的組裝。 論文信息 In Vivo Assembly and Expression of DNA Containing Non-canonical Bases in the Yeast Saccharomyces cerevisiae Dr. Hoai Nguyen, Dr. Mikhail Abramov, Prof. Jef Rozenski, Dr. Elena Eremeeva, Prof. Piet Herdewijn ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202200060
