核糖體失活蛋白（Ribosome-inactivating Proteins, RIPs）是一類廣泛存在于植物體的毒素蛋白。這類蛋白通常作用于核糖體上一個(gè)高度保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)使其水解脫去其中特定的腺嘌呤，從而抑制核糖體功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻。核糖體失活蛋白在抗動(dòng)植物病毒，抗腫瘤等眾多醫(yī)療方面有著潛在的應(yīng)用前景。然而研究核糖體失活蛋白的活性通常需要終止其脫嘌呤反應(yīng)，因此大部分方法不利于用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)活性和快速篩選核糖體失活蛋白的潛在抑制劑。為了解決這一問(wèn)題，美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥Yitzhak Tor課題組報(bào)道了一種通過(guò)一系列酶催化反應(yīng)，將同構(gòu)熒光鳥嘌呤核苷定點(diǎn)引入到核糖體失活蛋白的底物上，利用其熒光特性以及相對(duì)于天然鳥嘌呤的同構(gòu)性，進(jìn)而通過(guò)監(jiān)控?zé)晒鈴?qiáng)度的變化，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控核糖體失活蛋白的脫嘌呤進(jìn)程。
Yitzhak Tor 課題組利用具有熒光特性的兩種不同的同構(gòu)性鳥嘌呤（tzG, thG），設(shè)計(jì)了對(duì)核糖體失活蛋白的有熒光響應(yīng)的發(fā)夾RNA（Hairpin RNA）。為了減少繁瑣的有機(jī)合成步驟，該課題組利用T7 RNA 聚合酶，T4 激酶，T4連接酶等一系列酶催化反應(yīng)，成功將兩種熒光鳥嘌呤（tzG, thG）定點(diǎn)引入到脫嘌呤的鄰位位點(diǎn)上。這種酶催化的合成反應(yīng)條件溫和，高效，適用于單一引入熒光核苷到特定位置（圖1）。
圖1：酶催化反應(yīng)合成熒光修飾發(fā)夾RNA示意圖 針對(duì)不同底物的動(dòng)力學(xué)以及核糖體失活蛋白作用位點(diǎn)的分析，tzG和thG替代的發(fā)夾RNA都會(huì)對(duì)核糖體失活蛋白的脫嘌呤過(guò)程產(chǎn)生熒光響應(yīng)，而且動(dòng)力學(xué)常數(shù)（kapp）與磷32同位素標(biāo)記（32P）監(jiān)控得到的動(dòng)力學(xué)常數(shù)相近（圖二）。然而對(duì)于核糖體失活蛋白的脫嘌呤位點(diǎn)，tzG替代的發(fā)夾RNA保持著跟天然發(fā)夾RNA一致，而thG替代的發(fā)夾RNA作用位點(diǎn)從第十五號(hào)腺嘌呤轉(zhuǎn)移到了第九號(hào)腺嘌呤（圖三），這表明了不同結(jié)構(gòu)的熒光核苷引入會(huì)影響原始的天然發(fā)夾RNA的折疊以及核糖體失活蛋白的識(shí)別特性，從而導(dǎo)致了不同的脫嘌呤產(chǎn)物。 圖2：修飾的發(fā)夾RNA熒光強(qiáng)度變化對(duì)核糖體失活蛋白脫嘌呤過(guò)程動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。A. tzG 修飾發(fā)夾RNA。B. thG 修飾發(fā)夾RNA。C. tzG發(fā)夾RNA 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)擬合。D. thG發(fā)夾RNA反應(yīng)動(dòng)力學(xué)擬合。 圖3：修飾的發(fā)夾RNA與核糖體失活蛋白反應(yīng)過(guò)程 該熒光修飾的核糖失活蛋白底物可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控脫嘌呤進(jìn)程，而且步驟簡(jiǎn)單，省時(shí)高效，適用于快速篩選核糖體失活蛋白的抑制劑。該熒光底物的構(gòu)建對(duì)于幫助核糖體失活蛋白在抗病毒，抗菌，抗腫瘤等方面領(lǐng)域具有潛在的意義。 論文信息 Isomorphic Fluorescent Nucleosides Facilitate Real-Time Monitoring of RNA Depurination by Ribosome Inactivating Proteins Deyuan Cong, Dr. Yao Li, Paul T. Ludford III, Prof.?Dr. Yitzhak Tor 美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥Yitzhak Tor課題組叢德源為第一作者，Yitzhak Tor 博士為通訊作者 Chemistry – A European Journal DOI: 10.1002/chem.202200994
