丹麥技術(shù)大學(xué)John M. Woodley課題組研究人員在氣泡柱中使用NAD(P)H 氧化酶(NOX)進(jìn)行輔因子NAD(P)+的原位再生，研究并解釋了NOX在不同操作條件下的酶動(dòng)力學(xué)失活過程和機(jī)理，為進(jìn)一步在工業(yè)應(yīng)用過程中保持酶穩(wěn)定性提供了新視角。
生物酶催化的氧化反應(yīng)在化學(xué)選擇性、區(qū)位選擇性和立體選擇性方面優(yōu)勢明顯，在催化不對稱有機(jī)合成(如手性醇，酮，胺等活性藥物中間體的合成)過程中具有重要作用。該過程通常需要輔因子依賴型的氧化還原酶參與，而輔因子的循環(huán)再生對該過程經(jīng)濟(jì)可行性至關(guān)重要。NOX能夠以分子氧為底物催化輔因子原位再生，同時(shí)產(chǎn)生水作為副產(chǎn)物。對于酶促氧化反應(yīng)過程，體系中較低的溶氧量通常是該過程的限制因素并導(dǎo)致該過程進(jìn)行緩慢。因此，通過連續(xù)鼓泡不斷產(chǎn)生新的氣液界面能有效促進(jìn)氧氣的傳質(zhì)過程，使氧化反應(yīng)快速高效地進(jìn)行。 最近，丹麥技術(shù)大學(xué)John M. Woodley課題組在氣泡柱中通過連續(xù)鼓入空氣為酶促氧化過程提供充足的底物氧氣，并對NOX在氣液界面的酶動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。首先，實(shí)驗(yàn)對氣泡柱中0.05 g L-1 NOX酶溶液在鼓泡氣速分別為0.25 vvm 和 0.50 vvm時(shí)的酶活性進(jìn)行了實(shí)時(shí)檢測，發(fā)現(xiàn)NOX的半衰期分別為29 h和32 h，小于酶在4 ℃和25 ℃靜置時(shí)的半衰期533 h和87 h，且失活動(dòng)力學(xué)模型擬合顯示為兩級失活過程。在更高的鼓泡氣速0.75 vvm條件下，酶的半衰期延長至40 h且顯示為一級失活過程。這說明在較高鼓泡氣速條件下的酶具有更長的半衰期，雖然較高的氣速會提高溶液的含氣率和相應(yīng)的氣液界面面積而導(dǎo)致更多的酶暴露在氣液界面，但高氣速時(shí)的氣液界面在氣泡柱內(nèi)的停留時(shí)間較短，酶與界面之間的接觸時(shí)間縮短導(dǎo)致酶在界面處酶解聚-聚集失活的過程時(shí)間變短，因此酶具有更長的半衰期。此外，在較高的 NOX 濃度(0.25 g L-1)溶液中以0.25 vvm的氣速鼓泡也觀察到比低酶濃度時(shí)較長的半衰期和一級失活過程。最后，通過 SDS-PAGE 檢測初始的 NOX酶分子量并與鼓泡 60 h后的酶分子量進(jìn)行對比，結(jié)果分別為42.4 kDa 與 42.9 kDa，沒有顯著差異。這說明 NOX在鼓泡過程中的酶活性損失并非是酶解離為相應(yīng)的亞基導(dǎo)致的，而是NOX 在氣液界面處的酶解聚-聚集失活導(dǎo)致了酶的活性損失。這些結(jié)果表明雖然鼓泡產(chǎn)生的氣液界面加速了酶的失活，但通過合理的反應(yīng)器設(shè)計(jì)及操作條件控制能有效維持酶的高穩(wěn)定性，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)酶促氧化反應(yīng)過程的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 論文信息 In Situ Cofactor Regeneration Using NAD(P)H Oxidase: Enzyme Stability in a Bubble Column Jingyu Wang, John M. Woodley ChemCatChem DOI: 10.1002/cctc.202200255
