非血紅素雙核鐵酶可以在室溫下活化氧氣并用于催化反應(yīng)，甲苯單加氧酶是一類代表性的非血紅素雙核鐵酶，包括甲苯/鄰二甲苯單加氧酶等。甲苯/鄰二甲苯單加氧酶參與氧氣活化的雙核鐵中心在羥化酶亞基中，它催化反應(yīng)可以產(chǎn)生三種苯酚產(chǎn)物（圖1）。
圖1 甲苯/鄰二甲苯單加氧酶催化的反應(yīng) 該酶通過(guò)雙核鐵活性中心活化氧氣，其中的還原性二鐵位點(diǎn)可與氧氣反應(yīng)產(chǎn)生各種過(guò)氧中間體，包括過(guò)氧中間體P或P’，超氧中間體物種S，Q中間體或者X中間體等。在不同的亞類酶中，用于催化反應(yīng)的活性過(guò)氧中間體是不同的（圖2）。 圖2 在雙核鐵酶中存在的雙氧中間體 甲苯/鄰二甲苯單加氧羥化酶單鏈包括αβγ三個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖三），處于α結(jié)構(gòu)域的雙核鐵活性中心包括兩個(gè)組氨酸和四個(gè)谷氨酸，兩個(gè)鐵離子都是六配位結(jié)構(gòu)，Lippard課題組通過(guò)光譜實(shí)驗(yàn)提出了反應(yīng)活性過(guò)氧中間體為μ-η2:η2構(gòu)型，但并沒(méi)有直接的結(jié)構(gòu)證明該酶中的活性中間體是哪種構(gòu)型。 圖3 甲苯/鄰二甲苯單加氧羥化酶結(jié)構(gòu)和活性中心結(jié)構(gòu) 近日，華中科技大學(xué)廖榮臻課題組采用QM/MM方法對(duì)甲苯/鄰二甲苯單加氧羥化酶進(jìn)行理論計(jì)算模擬，揭示了可能的反應(yīng)活性過(guò)氧中間體結(jié)構(gòu)，探究了氧氧鍵斷裂和底物氧化是分步還是協(xié)同進(jìn)行的問(wèn)題，還闡釋了為何該酶可將甲苯氧化為苯酚產(chǎn)物而不是酮或者環(huán)氧化物產(chǎn)物。 圖4 分步反應(yīng)機(jī)理中掃描的反應(yīng)勢(shì)能面 通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)μ-η2:η2的過(guò)氧中間體是最穩(wěn)定的，通過(guò)主軌道相互作用分析發(fā)現(xiàn)是兩個(gè)鐵離子的3d軌道與過(guò)氧基團(tuán)的π*軌道形成的反饋鍵是主要成鍵成分。接下來(lái)對(duì)氧氧鍵斷裂和碳氧鍵形成的分步機(jī)理進(jìn)行研究。計(jì)算表明形成四價(jià)鐵物種Q的能壘是19.8 kcal/mol，對(duì)形成Q中間體的掃描勢(shì)能面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)從過(guò)氧中間體到Q中間體的過(guò)程中，會(huì)發(fā)生Fe1上的β電子轉(zhuǎn)移到氧氧鍵的σ*軌道上。在協(xié)同反應(yīng)機(jī)理中，發(fā)生氧氧鍵的斷裂和碳氧鍵形成的過(guò)渡態(tài)能壘為16.8 kcal/mol，形成碳氧鍵后的甲苯底物具有陽(yáng)離子性質(zhì)，第一步反應(yīng)為速率決定步驟。形成碳氧鍵中間體結(jié)構(gòu)后會(huì)發(fā)生不同形式的變化，其中發(fā)生質(zhì)子穿梭形成苯酚產(chǎn)物能壘很低且是放熱過(guò)程，而形成環(huán)氧化物或酮產(chǎn)物的能壘較高。 論文信息 QM/MM Calculations Suggested Concerted O?O Bond Cleavage and Substrate Oxidation by Nonheme Diiron Toluene/o-xylene Monooxygenase Tai-Ping Zhou, Wen-Hao Deng, Yuzhou Wu, Rong-Zhen Liao 文章的第一作者為華中科技大學(xué)碩士研究生周太平 Chemistry – An Asian Journal DOI: 10.1002/asia.202200490
