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為了應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2更具傳染性或侵襲性的變體，需要開發(fā)可以被快速調(diào)整的抗病毒藥物。SARS-CoV-2是一種正鏈單鏈RNA病毒，它通過人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（hACE2）受體進(jìn)入宿主細(xì)胞。病毒RNA基因組需要被不斷復(fù)制以組裝成新的病毒顆粒。此外，病毒基因組RNA會(huì)被復(fù)制成亞基因組mRNA（sgmRNA），用于病毒蛋白的合成。因此，在病毒感染期間，會(huì)產(chǎn)生兩種類型的單鏈RNA，基因組RNA和sgmRNA。原則上，小干擾RNA（siRNA）可同時(shí)靶向這兩種mRNA，實(shí)現(xiàn)雙重基因沉默。因此，基于siRNA的病毒mRNA降解可根據(jù)突變體的基因序列做出快速調(diào)整。因此，德國(guó)慕尼黑大學(xué)的Thomas Carell教授和Oliver T. Keppler教授課題組提出了基于siRNA降解SARS-CoV-2策略。

該研究評(píng)估了一系列siRNA對(duì)多種新冠病毒突變體的抗病毒活性。其中，2'-OMe修飾的siRNA同時(shí)具有血清穩(wěn)定性和抗病毒活性。作者進(jìn)一步通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將siRNA與肽配體（hACE2為受體）進(jìn)行綴合，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型特異性靶向的抗病毒功效，能夠有效抑制3D肺粘液纖毛肺微組織中的病毒復(fù)制和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

首先，為了探究基于siRNA的SARS-CoV-2病毒mRNA降解的可行性，作者分析了病毒的基因組結(jié)構(gòu)，并針對(duì)病毒RNA不同靶區(qū)域設(shè)計(jì)了幾種siRNA（L1、R-2 to R-5、S-6 to S-9）。其中，靶區(qū)域分別為5'-前導(dǎo)序列（L）、RNA依賴RNA聚合酶（RdRp，又稱Nsp12）編碼區(qū)和S蛋白編碼區(qū)（圖1a）。所有siRNA在各自的3'末端包含兩個(gè)2'-脫氧胸苷核苷酸，以增加抗核酸外切酶降解的穩(wěn)定性。作者首先在人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中評(píng)估了所設(shè)計(jì)的siRNA的功效，檢測(cè)到siRNA L-1（靶標(biāo)：L）、R-2和R-5（靶標(biāo)：RdRp）和S-6（靶標(biāo)：S）的基因沉默效率在80%和92%之間（圖1b）。在最初的預(yù)篩選之后，作者在Vero-E6細(xì)胞（感染B.3穿山甲譜系的SARS-CoV-2分離株）評(píng)估了這4種siRNA中的抗病毒效果。測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了siRNA R-2和S-6高效的抗SARS-CoV-2活性（圖1c，d）。當(dāng)病毒感染前1 h轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，siRNA R-2和S-6將病毒載量降低高達(dá)96%（圖1c），當(dāng)病毒感染后1 h轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，病毒載量降低高達(dá)99.95%（圖1d）?；谶@些結(jié)果，作者選擇siRNA R-2和S-6進(jìn)行進(jìn)一步研究（圖1e）。

為了獲得更詳細(xì)的功效數(shù)據(jù)，作者建立了一種測(cè)定方法，可以在高動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)量化SARS-CoV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。作者使用MDA-MB-231-hACE2細(xì)胞，該細(xì)胞過表達(dá)hACE2受體，這使細(xì)胞極易感染SARS-CoV-2。接下來，作者使用SARS-CoV-2（B.1.177 穿山甲譜系，20E.EU1）感染靶細(xì)胞MDA-MB-231-hACE2。數(shù)據(jù)顯示，與siRNA R-2或S-6相比，非靶向亂序siRNA Ctrl.-10轉(zhuǎn)染的細(xì)胞活力明顯降低（圖1f）。在使用MDA-MB-231-hACE2的測(cè)定中，siRNA R-2和S-6預(yù)處理可保護(hù)細(xì)胞不被VoCs Alpha（B.1.1.7，圖1g）和Beta（B.1.351，圖1h）感染致死。值得注意的是，siRNA R-2和S-6的組合特別有效（圖1f-h）。

接下來，作者使用SARS-CoV-2 VoC Delta（B.1.617.2，圖1i）測(cè)定了siRNA S-6的抗病毒作用。這里檢測(cè)到S-6的活性喪失與第21618位已知的C到G點(diǎn)突變一致，該突變直接位于siRNA的結(jié)合靶區(qū)域中。當(dāng)將S-6與R-2結(jié)合使用時(shí)，活性損失可以得到部分補(bǔ)償，但無法恢復(fù)至最大活性，這表明siRNA結(jié)合區(qū)域的突變對(duì)抗病毒活性產(chǎn)生了顯著影響。為了證明基于siRNA的策略可以快速適應(yīng)病毒突變，作者調(diào)整了S-6序列（S-6δ）以對(duì)應(yīng)VoC Delta中的突變，與預(yù)期一致，S-6δ重新具備了抗病毒活性（圖1i）。這一結(jié)果證明了基于siRNA治療藥物的快速適應(yīng)性。

所有臨床使用的基于siRNA的治療劑都具有修飾的核苷，在靠近硫代磷酸酯的位置帶有2' OMe或2' F取代基，從而增加對(duì)人血清核酸內(nèi)切酶的抗性（圖2a）。作者制備了完全修飾的siRNA S-6^fm（圖2b）。然而，在隨后的功效研究中觀察到完全修飾的siRNA基因沉默能力降低了40%（圖2b）。因此，作者篩選了具有不同修飾的siRNA的抗病毒活性，發(fā)現(xiàn)部分修飾的S-6（只有四個(gè)2'-OMe修飾，S-6^m），在血清中具有所需的穩(wěn)定性，并且同時(shí)保留了抗病毒活性（圖2c-d）。作者進(jìn)一步對(duì)部分修飾的siRNA S-6^m的活性進(jìn)行了定量評(píng)估。結(jié)果顯示，用S-6^m預(yù)處理可在siRNA濃度低至2 nM時(shí)防止細(xì)胞死亡（圖2e)。重要的是，S-6^m在2 nM和0.2 nM時(shí)與未修飾的S-6相比具有更好保護(hù)作用（圖2f）。

為了探究是否可以在沒有轉(zhuǎn)染劑的情況下，將siRNA遞送到肺微組織中，作者使用受體配體對(duì)siRNA進(jìn)行了化學(xué)修飾，預(yù)期siRNA-配體綴合物將有助于細(xì)胞遞送。對(duì)于siRNA修飾，作者使用了高效且溫和的Cu(I)催化點(diǎn)擊化學(xué)，借助炔烴與疊氮的反應(yīng)，將siRNA的正義鏈連接到已知與hACE2受體相互作用的短肽上，作為SARS-CoV S蛋白受體結(jié)合域的一部分（圖3a）。通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析證實(shí)了肽-siRNA偶聯(lián)物S-6^m-P sense的成功合成后，將S-6^m-P sense鏈與相應(yīng)的S-6^m antisense鏈雜交，得到肽修飾的siRNA嵌合體S-6^m-P。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到了siRNA被攝取到Caco-2細(xì)胞中，這種攝取依賴于siRNA與肽的綴合（圖3b）。然而，與基于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的遞送相比，肽介導(dǎo)的siRNA攝取到細(xì)胞中的效率要低得多。

接下來，作者探究了肽修飾的siRNA（S-6^m-P）是否可以阻止SARS-CoV-2在人類3D粘液纖毛肺EpiAirway微組織中的復(fù)制。結(jié)果觀察到，siRNA肽嵌合體S-6^m-P對(duì)SARS-CoV-2的抑制作用與臨床藥物瑞德西韋（RDV）相當(dāng)（圖3c）。此外，S-6^m-P能夠有效抑制四種病毒轉(zhuǎn)錄物（sgmRNAs）在感染的細(xì)胞中合成，這四種病毒轉(zhuǎn)錄物分別對(duì)應(yīng)了核衣殼蛋白（N）、刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）（圖3d）。隨后，作者進(jìn)行了RNA熒光原位雜交，以進(jìn)一步量化肺微組織中的SARS-CoV-2陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果觀察到S-6^m-P預(yù)處理后，感染細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（圖3e、f）。重要的是，在未經(jīng)處理的SARS-CoV-2感染組織中檢測(cè)到了病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但在用S-6^m-P或RDV預(yù)處理后未檢測(cè)到（圖3g），這些數(shù)據(jù)證明了S-6^m-P的有效性。

然而，作者注意到盡管對(duì)肺微組織進(jìn)行了siRNA處理，但通過RT-qPCR在上清液中仍可檢測(cè)到病毒的存在（圖3c）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，作者重新研究了使用siRNA S-6^m和lipofectamine轉(zhuǎn)染的病毒滴定實(shí)驗(yàn)。雖然細(xì)胞活力數(shù)據(jù)表明，在感染后72 h完全抑制病毒復(fù)制（圖4a），但相比之下，殘留的病毒仍可通過RT-qPCR檢測(cè)到（圖4b），S-6^m和Ctrl.-10之間Ct值差異較小。為了排除可能的由引物特異性造成的差異，作者使用RdRp、E和M基因靶向引物進(jìn)行了額外的PCR定量，并觀察到S-6^m對(duì)S基因的影響最強(qiáng)（圖4c）?；谶@些結(jié)果，作者假設(shè)S-6^m誘導(dǎo)了高度特異性的病毒RNA降解，但僅限于siRNA靶向區(qū)域。作者推斷這可能導(dǎo)致缺乏S蛋白的缺陷病毒顆粒的分泌，因此這些缺陷病毒顆粒是非傳染性的。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者進(jìn)行了上清液轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，其中siRNA預(yù)處理的SARS-CoV-2感染的A549-hACE2細(xì)胞的培養(yǎng)上清液用于攻擊MDA-MB-231-hACE2細(xì)胞（圖4d）。結(jié)果表明，R-2、S-6^m、特別是R-2+S-6^m處理的A549-hACE2細(xì)胞的上清液，沒有顯示出SARS-CoV-2感染并釋放傳染性病毒顆粒的證據(jù)（圖4e）。這些數(shù)據(jù)表明，基于PCR的抗病毒作用分析確實(shí)低估了siRNA的抗病毒作用。這一結(jié)果對(duì)于未來抗病毒siRNA的開發(fā)具有重要意義。

總的來說，該研究基于siRNA降解SARS-CoV-2策略的優(yōu)勢(shì)在于它的靈活性，如果病毒靶RNA序列發(fā)生突變，則可以快速調(diào)整相應(yīng)的siRNA。此外，該策略還允許同時(shí)靶向多個(gè)病毒基因組位點(diǎn)。由于Omicron VoC (BA.1)與Alpha和Beta VoC基因組序列相似，Omicron VoC (BA.1)變體在本研究所靶向的RNA區(qū)域未發(fā)生突變，作者預(yù)計(jì)此處報(bào)道的siRNA序列在該變體上也具有活性。