RNA干擾（RNAi）技術(shù)的為研究植物基因功能、信號(hào)通路和作物育種等領(lǐng)域提供了有力的工具。目前小干擾RNA(siRNA)在完整植物細(xì)胞中的遞送一般依賴于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和病毒遞送手段，但這些遞送方式通常會(huì)產(chǎn)生隨機(jī)的基因組整合，導(dǎo)致siRNA的不可控表達(dá)，從而難以精準(zhǔn)控制基因沉默周期，因而需要發(fā)展新型遞送手段來(lái)實(shí)現(xiàn)高效、瞬時(shí)的基因沉默。然而, 由于完整植物細(xì)胞致密堅(jiān)韌而又多層的細(xì)胞壁阻礙了大尺寸物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致了外源生物分子難以被有效遞送。
圖1 GONs-siRNA在完整植物細(xì)胞中基因沉默的示意圖 針對(duì)這些問(wèn)題，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)韓鶴友教授課題組將RNAi與納米技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種氧化石墨烯納米顆粒介導(dǎo)的siRNA遞送系統(tǒng),在無(wú)外力下實(shí)現(xiàn)在完整植物細(xì)胞中高效，瞬時(shí)的基因沉默。此前尚未有概念認(rèn)為氧化石墨烯可以作為生物分子的遞送載體用于植物系統(tǒng)，這主要是由于未經(jīng)處理的氧化石墨烯為微米級(jí)的大尺寸二維結(jié)構(gòu)，難以在植物組織內(nèi)傳遞并穿透細(xì)胞壁內(nèi)化。韓鶴友教授團(tuán)隊(duì)采用功能性高分子修飾,機(jī)械破碎分離的技術(shù)手段，制備出100nm左右的氧化石墨烯納米顆粒(GONs)。如圖1所示，研究發(fā)現(xiàn)GONs能夠高效搭載siRNA并進(jìn)一步縮小為20-30nm左右的小尺寸球狀納米復(fù)合物（GONs-siRNA），同時(shí)該GONs載體具有使用簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，保護(hù)siRNA等優(yōu)點(diǎn)。 圖2 GONs-siRNA的表征 團(tuán)隊(duì)使用了一種轉(zhuǎn)基因煙草(N.benthamiana 16C),其能夠在細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)源綠色熒光蛋白（GFP）。如圖3所示，在激光共聚焦顯微鏡（CLSM）的觀察下，GONs-siRNA能夠?qū)y3標(biāo)記的siRNA有效遞送進(jìn)煙草細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）與CLSM觀察，GONs-siRNA展現(xiàn)出與植物細(xì)胞壁強(qiáng)烈的親和，大部分顆粒附著于細(xì)胞壁表面，部分GONs-siRNA直接跨越細(xì)胞壁內(nèi)化進(jìn)植物細(xì)胞。 圖3 GONs遞送siRNA進(jìn)入植物細(xì)胞 如圖4所示，團(tuán)隊(duì)使用該方式遞送靶向內(nèi)源性GFP的siRNA，在24 h實(shí)現(xiàn)了mRNA水平97%左右的高效基因沉默，同時(shí)在48 h出現(xiàn)蛋白表達(dá)的顯著下降。重要的是，GONs介導(dǎo)的基因沉默具有明顯的瞬時(shí)性，靶標(biāo)mRNA在 72 h恢復(fù)到正常水平的66%左右，在120 h 完全恢復(fù)到正常水平。靶標(biāo)基因的蛋白表達(dá)也在72 h后開(kāi)始恢復(fù)，120 h完全恢復(fù)到正常水平。同樣的，對(duì)煙草內(nèi)源基因NbPDS與NbSGS3的基因沉默也產(chǎn)生明顯的抑制與快速恢復(fù)。值得一提的是，這種GONs載體具有良好的生物相容性，在整個(gè)研究過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)對(duì)植物細(xì)胞的損傷。 圖4 GONs-siRNA在植物中產(chǎn)生基因沉默 該成果首次證明了氧化石墨烯能夠作為siRNA遞送遞送應(yīng)用于植物系統(tǒng)。這種瞬時(shí)高效的新策略將促進(jìn)納米材料作為植物基因工程工具的應(yīng)用。 論文信息 Efficient Gene Silencing in Intact Plant Cells Using siRNA Delivered By Functional Graphene Oxide Nanoparticles Dr. Shuojun Li, Dr. Jiaying Li, Dr. Moqing Du, Dr. Guiyun Deng, Prof.?Dr. Zhiyong Song, Prof.?Dr. Heyou Han 本文的第一作者為博士研究生李爍鈞，通訊作者為韓鶴友教授。該研究得到了“國(guó)家自然科學(xué)基金”（21778020, 21807036）等項(xiàng)目的資助。 Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202210014
