傳染性疾病是對人類的持續(xù)威脅。目前，核酸檢測是診斷此類疾病的標準方法之一，但具有昂貴和檢測結(jié)果滯后的問題。因此，發(fā)展廉價且靈敏的核酸檢測方法對即時診斷（POC）和抑制傳染病擴散具有重要價值。最近，基因編輯技術(shù)CRISPR被大量用于核酸檢測，成為下一代快速核算檢測的熱門選項。然而，基于 CRISPR 的生物傳感器通常依賴于比色、熒光或電化學信號機制，因此需要用到比較昂貴的信號分子（比如，熒光標記的信號分子）或者復雜的檢測設備。這些缺點阻礙了CRISPR檢測技術(shù)在現(xiàn)實中的真正應用。
近日，北卡州立大學化學和生物分子工程系魏青山教授課題組發(fā)現(xiàn)了一種新型的CRISPR反式剪切信號分子，可以用來構(gòu)建非光學，廉價，同時又高度靈敏CRISPR傳感平臺，為CRISPR檢測技術(shù)的實際應用開辟了新思路。
這個基于CRISPR-Cas12a 的傳感平臺通過將雙鏈 λ DNA （一種廉價的噬菌體DNA）進行反式剪切（trans-cleavage）并根據(jù)剪切碎片的大小來確定單鏈DNA 靶標的濃度（圖1）。信號分子碎片的大小與靶標的濃度成反比，并可以通過簡易的凝膠電泳分析定量分析。因而排除了熒光標記，電化學讀取等復雜步驟。
圖1，非光學CRISPR傳感器原理示意圖 雖然在信號讀取上，新的方法進行了簡化處理，但其檢測性能沒有受到影響。比如，新的CRISPR傳感器可以通過一步反應，不需要任何預擴增反應就達到費米（fM）級檢測靈敏度（圖2）。這個靈敏度甚至比傳統(tǒng)的基于熒光信號分子的反應都要靈敏100倍。 圖2，利用信號分子尺寸變化，新CRISPR傳感器可以達到費米（fM）級檢測靈敏度 這項研究最創(chuàng)新的一點是證明了Cas12a酶可以反式剪切非常穩(wěn)定的雙鏈DNA分子，比如擁有4萬8千堿基對的雙鏈λ DNA。通常我們認為Cas12a酶只能剪切單鏈DNA分子。這個研究觀察到了兩點有趣的實驗現(xiàn)象：1）單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)能增強雙鏈DNA的反式剪切活性；2）Cas12a酶跟λ DNA之間有很強的結(jié)合親和力。這兩點或許導致了新型非光學CRISPR傳感器超靈敏的檢測性能。然而，雙鏈λ DNA反式剪切的具體機理需要進一步研究。 總之，利用 λ DNA 物理尺寸變化進行濃度標定的概念開啟了使用各種雙鏈DNA 作為 CRISPR 報告分子的可能性，極大的豐富了信號分子的設計性和選擇性。 論文信息 A Sensitive and Nonoptical CRISPR Detection Mechanism by Sizing Double-Stranded λ DNA Reporter Noor Mohammad, Shrinivas S Katkam, and Qingshan Wei Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202213920
