近期，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院報道了獨特的、具有雙功能的安布替星脫水酶（AmbDH3）的底物識別特性與催化分子機(jī)制，對深入理解聚酮合酶脫水酶，并進(jìn)一步開發(fā)利用其功能提供了理論指導(dǎo)。石婷副研究員為通訊作者，其指導(dǎo)的碩士生杜澤乾為第一作者。
脫水酶（dehydratase, DH）位于聚酮合酶（polyketide synthase, PKS）模塊中，一般通過形成水分子，脫去聚酮鏈上β-羥基，從而增添一個α-β不飽和雙鍵修飾。研究發(fā)現(xiàn)，安布替星聚酮合酶模塊3中的DH結(jié)構(gòu)域（AmbDH3）不僅發(fā)揮脫水作用，也負(fù)責(zé)隨后的環(huán)化反應(yīng)，是首個報道的同時具有脫水與環(huán)化功能的脫水酶。
安布替星（Ambruticins）可以激活高摩爾甘油蛋白激酶途徑從而抑制真菌生長，是開發(fā)抗真菌藥物的重要前體結(jié)構(gòu)。此外，AmbDH3通過分子內(nèi)oxy-Michael加成反應(yīng)，實現(xiàn)了手性飽和氧雜環(huán)（chiral saturated oxygen heterocycles, CSOH）的合成，有望極大地簡化CSOH的合成過程，具有潛在的應(yīng)用價值。
在該研究中，研究人員結(jié)合MD模擬和QM/MM計算，闡明了AmbDH3對底物C2位手性的選擇性、對C6位手性的耐受性以及其催化脫水和環(huán)化的反應(yīng)機(jī)制。
首先，構(gòu)建底物C2位為S手性的2S底物（2S6R-1）和 2R底物（2R6R-2 and 2R6S-3）。MD模擬表明，2R底物可以與H51和G61形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，而使其Hα朝向H51，有利于脫水反應(yīng)的發(fā)生；而2S底物的Hα則背對H51，使其不宜發(fā)生脫水反應(yīng)。此外，結(jié)合自由能計算表明2R底物比2S底物與AmbDH3結(jié)合得更緊密。能量分解找到了在識別過程中起重要作用的殘基（圖1）。
其次，解析了直接和間接的兩條脫水途徑，QM/MM計算表明直接脫水更具能量優(yōu)勢，其反應(yīng)能壘為25.2 kcal/mol. 隨后，針對是否有水分子參與環(huán)化路徑進(jìn)行計算分析，結(jié)果表明沒有水分子參與的直接環(huán)化反應(yīng)能壘更低，為24.5 kcal/mol。這樣，研究人員就完整解析了AmbDH3僅通過一個活性氨基酸H51就催化完成了整個脫水與環(huán)化的過程（圖2）。
最后，由于脫水后的中間產(chǎn)物C6位存在手性差異，構(gòu)建底物6R-4和6S-5 與AmbDH3的計算模型，研究發(fā)現(xiàn)6R-4向內(nèi)彎曲成環(huán)，而6S-5向外彎曲成環(huán)，此過程中6R-4和6S-5都可以與酶形成較為穩(wěn)定的氫鍵，但6S-5底物因氫鍵作用表現(xiàn)出更多更穩(wěn)定的構(gòu)象，因此環(huán)化效率更高（圖3）。
總之，該研究工作從原子分子水平闡明了第一個已知的具有脫水和環(huán)化雙功能脫水酶AmbDH3的識別和催化機(jī)制，這將為如何設(shè)計AmbDH3以實現(xiàn)通過化學(xué)酶法合成含有特定手性吡喃類天然產(chǎn)物的應(yīng)用提供指導(dǎo)性意見。
圖1：（A）通過能量分解得到貢獻(xiàn)超過1.0 kcal mol-1的殘基；（B）G61和H51與底物形成氫鍵。(C)限制性MD模擬中，2S底物與H51和G61之間的氫鍵被破壞，使體系中的構(gòu)象不穩(wěn)定；(D)無約束條件下，2S底物與H51和G61之間的氫鍵使得甲基面向H51而不是Hα，阻礙了底物Hα的離去。 圖2：（A）AmbDH3催化脫水與環(huán)化的反應(yīng)能壘；（B）優(yōu)化得到直接脫水和直接環(huán)化反應(yīng)路徑上的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)。 圖3：體系6R-4（A）和體系6S-5（B）聚類結(jié)構(gòu)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)；（C）體系6R-4和6S-5中H51、G61和D215的氫鍵百分比；（D）兩個體系中與環(huán)化反應(yīng)有關(guān)的兩個關(guān)鍵距離d（Nε-H3）和d（O3-C2）的分布。 論文信息 Molecular Insights into Bifunctional Ambruticin DH3 for Substrate Specificity and Catalytic Mechanism Zeqian Du, Yongzhen Li, Yihan Liu, Ting Shi Chemistry – A European Journal DOI: 10.1002/chem.202203420
