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新冠病毒（SARS-CoV-2）感染引起的新冠肺炎嚴重影響人類健康和全球社會經(jīng)濟發(fā)展。因此，開展防治新冠狀病毒感染相關(guān)的基礎(chǔ)研究和新藥研發(fā)具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。病毒蛋白酶是抗病毒藥物研發(fā)的理想靶標，新冠病毒3C樣蛋白酶（3CL^pro或M^pro）的抑制劑——奈瑪特韋（Nirmatrelvir）已獲批用于新冠肺炎的治療。木瓜樣蛋白酶（PL^pro）在冠狀病毒復(fù)制和對抗宿主天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是抗冠狀病毒藥物研發(fā)的潛在新靶點。然而，為了特異性識別水解底物中的GG序列，PL^pro底物結(jié)合口袋中催化殘基C111附近的空間狹長且相對封閉，難以被抑制劑占據(jù)，導(dǎo)致針對催化位點的抑制劑（即正構(gòu)抑制劑）尤其是共價抑制劑的設(shè)計難度大而進展緩慢。目前已報道的PL^pro抑制劑抑制結(jié)構(gòu)類型單一且活性較弱，尚未有任何抑制劑進入臨床研究。針對這一現(xiàn)狀，別構(gòu)抑制劑的設(shè)計與發(fā)現(xiàn)為該靶點的新藥研發(fā)提供重要選項。

近日，中國科學(xué)院上海藥物研究所許葉春研究員課題組和上海高等研究院上海光源科學(xué)中心的李敏軍博士合作，從篩選得到的SARS-CoV-2 PL^pro激動劑出發(fā)，通過對激動劑的作用機制研究，首次發(fā)現(xiàn)270位半胱氨酸殘基（C270）是別構(gòu)調(diào)節(jié)該水解酶活性的重要位點，并進一步鑒定了共價作用于該位點的內(nèi)源性激動劑和設(shè)計了靶向該位點的首個共價別構(gòu)抑制劑。

研究人員在針對老藥和臨床在研候選藥物開展SARS-CoV-2 PL^pro的抑制劑篩選中，意外發(fā)現(xiàn)地美司鈉（Dimesna）和吡硫醇（Pyritinol）兩個老藥對SARS-CoV-2 PL^pro具有明顯的激動作用?？紤]到兩個激動劑中均包含二硫鍵，推測其可能通過共價作用于蛋白酶中的半胱氨酸而起效，通過對SARS-CoV-2 PL^pro表面四個半胱氨酸的突變而進一步識別C270是激動劑實現(xiàn)共價別構(gòu)調(diào)控蛋白酶水解活性的作用位點。

聯(lián)想到內(nèi)源性物質(zhì)谷胱甘肽GSSG（氧化型谷胱甘肽）也包含二硫鍵，研究人員測定了谷胱甘肽對SARS-CoV-2 PL^pro酶活的影響效應(yīng)。不出意外，研究結(jié)果表明谷胱甘肽通過共價作用于C270而別構(gòu)激活SARS-CoV-2 PL^pro。進一步研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 PL^pro在細胞內(nèi)因內(nèi)源性谷胱甘肽的存在而表現(xiàn)出更高的水解活性。由于C270只存在于SARS-CoV和SARS-CoV-2的PL^pro中，在其他冠狀病毒的PL^pro中該位點并非半胱氨酸，因此推測谷胱甘肽對SARS-CoV-2 PL^pro的激活作用可能與新冠病毒高傳染性和致病性相關(guān)，當(dāng)然這需要更多的實驗驗證。

隨后，研究人員對C270進行了點突變以測試不同氨基酸取代對蛋白酶水解活性的影響，發(fā)現(xiàn)帶正電荷的氨基酸取代能夠部分抑制PL^pro的酶活。受此啟發(fā)，研究人員找到了同時攜帶二硫鍵和正電荷的化合物DMGA，酶活測試表明DMGA能有效抑制劑SARS-CoV-2 PL^pro水解活性，IC₅₀為9.4 μM。進一步通過多種生化實驗的驗證，發(fā)現(xiàn)DMGA確實通過共價作用于C270而別構(gòu)抑制SARS-CoV-2 PL^pro酶活。

因此，研究人員以意外發(fā)現(xiàn)的激動劑為工具分子進行深入研究，首次發(fā)現(xiàn)C270作為調(diào)節(jié)SARS-CoV-2 PL^pro酶活性的共價別構(gòu)位點，而DMGA作為靶向該位點的首個共價別構(gòu)抑制劑驗證了該位點的有效性。該研究結(jié)果為設(shè)計新型的SARS-CoV-2 PL^pro抑制劑提供了重要線索，同時也為抗病毒藥物的研發(fā)提供了新思路。