中國科學院青島生物能源與過程研究所叢志奇研究員課題組與山東大學李盛英教授課題組合作通過蛋白質(zhì)工程對雙功能小分子促進的P450過加氧酶進行實驗室改造，開發(fā)出從吲哚及其衍生物出發(fā)催化靛藍類染料合成的新型工程化P450酶，催化效率優(yōu)于已報道的最佳氧化酶，為靛藍類燃料的生物合成提供了新的策略和思路。
圖1 (A)氧化酶催化吲哚羥化合成靛藍的主要途徑。(B) 雙功能小分子協(xié)同P450BM3過加氧酶體系的催化循環(huán)(左)，雙功能小分子的一般結(jié)構(gòu)(DFSM，右上)，N-(ω-咪唑基)-己?；?L-苯丙氨酸的分子結(jié)構(gòu)(Im-C6-Phe，右下)。 靛藍作為重要的天然著色劑，是我們?nèi)粘Ｉ钪信Ｗ幸卵澋娜旧?，并且廣泛用于印染、食品、醫(yī)藥和電子材料行業(yè)。傳統(tǒng)的植物提取工藝繁瑣，產(chǎn)量低；化學合成方法有毒副產(chǎn)物、危害健康，所以開發(fā)環(huán)保高效的生物合成方法顯得尤為重要。近年來微生物合成方法被廣泛報道，但是酶合成方法因具有反應周期短、產(chǎn)物易分離等優(yōu)點成為更合適的生物催化策略。細胞色素P450單加氧酶是公認的多功能生物氧化催化劑，已報道的工程P450酶生物合成靛藍的產(chǎn)量較低不能滿足工業(yè)應用的需求。另外，絕大多數(shù)P450單加氧酶催化功能的實現(xiàn)高度依賴提供還原力的輔酶NAD(P)H和負責電子傳遞的還原伴侶蛋白，這在一定程度上限制了其體外催化應用。針對以上問題，叢志奇研究員前期開發(fā)了“雙功能小分子協(xié)同P450過加氧酶”策略，成功將單加氧酶P450BM3改造為以過氧化氫作為末端氧化劑的P450過加氧酶，為P450催化的非天然底物氧化轉(zhuǎn)化提供了新的策略。 最近，研究人員通過連續(xù)的實驗室進化策略（理性設計、定向進化、半理性設計），獲得雙功能小分子促進的P450過加氧酶優(yōu)勢突變酶，能夠高選擇性催化吲哚合成靛藍，是目前報道酶催化合成靛藍中的最佳氧化酶。另外，以12種不同取代吲哚衍生物為原料制備了不同產(chǎn)率（31.3%-79.5%）的靛藍類染料，證明該體系具有廣泛的底物普適性，6,6’-二氟靛藍的產(chǎn)率達到79.5%，優(yōu)于目前報道最好的氧化酶PTDH-mFMO。其中優(yōu)勢突變酶對典型吲哚衍生物的催化效率(kcat/Km)為182-2849 mM-1·min-1，優(yōu)于目前報道的所有P450酶。該研究顯示蛋白質(zhì)工程與雙功能小分子協(xié)同P450過加氧酶策略的有機結(jié)合實現(xiàn)了靛藍類衍生物的高效生物合成，為生物合成靛藍類染料提供了新的酶催化途徑，為生物工業(yè)化合成靛藍類染料提供了新的思路。 論文信息 Evolving a P450BM3 Peroxygenase for the Production of Indigoid Dyes from Indoles Fanhui Kong, Jie Chen, Xiangquan Qin, Chuanfei Liu, Yiping Jiang, Li Ma, Prof. Huifang Xu, Prof. Shengying Li, Prof. Zhiqi Cong ChemCatChem DOI: 10.1002/cctc.202201151
