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山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李盛英教授團(tuán)隊(duì)在ChemSusChem期刊發(fā)文，設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了一種基于雙熒光檢測的PET塑料水解酶高通量篩選方法。通過在96孔板中制備包埋淬滅熒光探針的PET膜，以及酶的熒光蛋白標(biāo)記，分別實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物與酶濃度的高通量檢測，并通過該方法成功從構(gòu)建的隨機(jī)突變體庫中篩選獲得高活性的PET塑料水解酶突變體。

合成塑料為人類生活帶來革命性改變的同時(shí)也造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題。聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）是產(chǎn)量最高的聚酯類塑料，也是回收率最高的塑料之一。近年來高活性PET水解酶的發(fā)現(xiàn)及其酶工程改造在PET降解回收方面均有重要進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)了PET酶解為單體，再利用獲得的單體進(jìn)行PET再生產(chǎn)的循環(huán)經(jīng)濟(jì)，既能實(shí)現(xiàn)廢棄塑料的再利用，也能擺脫對石油基原料的依賴。然而，這一技術(shù)目前主要瓶頸在于其成本遠(yuǎn)高于石油基原料，而解決這一問題的關(guān)鍵在于獲得高活性PET水解酶突變體。然而，目前該酶的篩選方法涉及大量的蛋白純化與產(chǎn)物的色譜檢測，使得PET水解酶的定向進(jìn)化不得不向低通量的功能驗(yàn)證“妥協(xié)”。

山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李盛英教授團(tuán)隊(duì)在ChemSusChem期刊發(fā)表關(guān)于PET水解酶高通量篩選方法的研究論文。設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了基于96孔板的PET水解酶高通量篩選，主要挑戰(zhàn)在于通過直接讀板快速連續(xù)測定產(chǎn)物和酶的濃度。作者首先利用一個(gè)深紅色熒光蛋白實(shí)現(xiàn)了PET水解酶突變體庫的熒光標(biāo)記：96孔板培養(yǎng)的突變體表達(dá)菌株通過裂解緩沖液提取胞內(nèi)蛋白后，可直接通過酶標(biāo)儀確定各孔的酶濃度，隨后加入反應(yīng)平板Plate 2中進(jìn)行反應(yīng)。在Plate 2的各孔的底部含有包埋熒光探針的PET涂層，該涂層由PET、熒光素雙月桂酸酯（FDL）共溶于有機(jī)溶劑后加入到96孔板中蒸發(fā)后形成，F(xiàn)DL只有當(dāng)PET被水解后才能被釋放并水解產(chǎn)生有綠色熒光的熒光素。因此，PET水解產(chǎn)物濃度可通過綠色熒光進(jìn)行連續(xù)、快速定量。兩次熒光檢測過程中，熒光蛋白的檢測波長與熒光素檢測波長相差150 nm，且實(shí)驗(yàn)表明它們不會(huì)相互干擾各自熒光的檢測。該方法能夠從大規(guī)模的突變體庫中快速鎖定高活性突變體，為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者構(gòu)建了IsPETase的隨機(jī)突變體庫，從2850個(gè)突變體中快速篩選獲得了8個(gè)候選突變，并通過酶活測定發(fā)現(xiàn)其中有6個(gè)活性顯著提高的突變體。作者相信，利用該方法及現(xiàn)有的自動(dòng)化篩選系統(tǒng)，可對更大規(guī)模的突變體庫進(jìn)行篩選，從中獲得更多的有益突變，有助于PET水解酶，乃至其他不溶性聚合物水解酶的活性及穩(wěn)定性提升。