硝基化合物作為一種高附加值的化工中間體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、炸藥等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。目前，工業(yè)硝化方法主要采用以硝酸、硫酸“混酸”的方式，具有產(chǎn)物區(qū)域選擇性差，環(huán)境污染嚴重以及反應(yīng)條件苛刻等多種缺陷。因此，尋求生物硝化方法來解決目前工業(yè)硝化存在的嚴重問題具有重要意義。
目前已經(jīng)報道的硝化酶大致可分為N-加氧酶、過氧化物酶和細胞色素P450酶三大類，但由于它們普遍具有催化效率底，底物特異性高和產(chǎn)物區(qū)域選擇性差等問題，還遠遠不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。因此，開發(fā)新型生物硝化酶，解決目前工業(yè)硝化存在的嚴重問題同時滿足日益增長的化工原料需求具有重要意義。
在前期研究中，研究人員利用酶化學(xué)機制指導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程策略將雙功能小分子（DFSM）協(xié)同P450酶催化體系由過加氧酶轉(zhuǎn)換為過氧化物酶，這為實現(xiàn)不飽和碳氫化合物的直接硝化提供了新的思路。研究人員首先嘗試加入亞硝酸鈉作為硝酸根供體，通過DFSM協(xié)同P450酶催化策略實現(xiàn)愈創(chuàng)木酚的硝化，通過改變其氧化還原敏感殘基，提高其硝化活性，但是反應(yīng)中仍然有大量羥化產(chǎn)物生成。研究人員考慮將原來在過加氧反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用的氨基酸位點F87A突變?yōu)镕87L，引入空間位阻效應(yīng)，阻止底物靠近活性中心發(fā)生過加氧反應(yīng)，而激發(fā)了其過氧化物酶功能，催化苯酚的硝化，結(jié)果顯示其硝化活性得到顯著提高, TTN 由186提高到556，硝化產(chǎn)物比例由2%提高到100%。同時結(jié)合活性口袋關(guān)鍵位點疊加突變，獲得了苯酚的最優(yōu)三突變體。以愈創(chuàng)木酚和苯酚的優(yōu)勢突變體構(gòu)建小型突變體庫，拓展底物范圍，實現(xiàn)了對19個芳香化合物高效硝化，其中4-氟苯酚的硝化活性最高，TON為1647，對其進行半制備反應(yīng)，分離產(chǎn)率達到48.8%。
迄今為止，末端芳香烯烴化合物的直接硝化仍未見報道，研究人員利用已構(gòu)建的人工P450硝化酶成功實現(xiàn)了苯乙烯的直接硝化反應(yīng)。拓展底物范圍，實現(xiàn)9個取代苯乙烯類化合物的直接硝化，結(jié)果表明帶富電子基團的苯乙烯衍生物硝化活性比鹵代苯乙烯高，其中對甲氧基苯乙烯硝化活性最高，TTN為663。該反應(yīng)機理也通過晶體學(xué)研究得到了驗證。 這一研究獲得了迄今為止催化效率最高、底物范圍最廣的人工P450硝化酶, 極大地促進了人工P450酶的過氧化物酶功能的開發(fā)，同時為生物催化硝化開辟了新的途徑。 論文信息 Engineering Cytochrome P450BM3 Enzymes for Direct Nitration of Unsaturated Hydrocarbons Xiling Wang, Xiaodan Lin, Yiping Jiang, Xiangquan Qin, Nana Ma, Fuquan Yao, Sheng Dong, Chuanfei Liu, Yingang Feng, Longyi Jin, Mo Xian, Zhiqi Cong Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202217678
