生物乙醇是最有前景的可持續(xù)可再生資源之一，其大規(guī)模生產(chǎn)有可能解決當(dāng)前世界的環(huán)境和能源挑戰(zhàn)。穩(wěn)定的纖維素酶在生物乙醇發(fā)酵中起著關(guān)鍵作用，然而生產(chǎn)過程中逐漸增加的乙醇濃度會(huì)抑制酶的活性，甚至導(dǎo)致酶失活，從而嚴(yán)重制約乙醇產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。
蛋白質(zhì)工程能夠定向改造各種酶，以滿足不同的工業(yè)應(yīng)用需求。近日，南京師范大學(xué)黃和教授LICME課題組，以內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A（PvCel5A）作為研究模型，借助InSiReP 2.0策略 (In Silico guided Recombination Process)成功進(jìn)化出高魯棒性的PvCel5A突變體，并實(shí)現(xiàn)了乙醇產(chǎn)量的大幅度提高。
在InSiReP 2.0的前兩個(gè)階段 (圖1)，研究人員以乙醇耐受性為篩選條件，結(jié)合Casting epPCR和20c-Tang技術(shù)最終確定了12有益單點(diǎn)突變。在第三階段，應(yīng)用CompassR策略，通過計(jì)算ΔΔGfold指導(dǎo)重組過程，得到了多個(gè)乙醇耐受型PvCel5A變體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些變體對(duì)發(fā)酵抑制劑和高溫具有耐受性，有優(yōu)秀的工業(yè)應(yīng)用潛力。
通過分子動(dòng)力學(xué)模擬的綜合計(jì)算研究，發(fā)現(xiàn)局部微調(diào)的靈活性和底物結(jié)合位點(diǎn)的溶解作用共同增強(qiáng)了PvCel5A變體的乙醇耐受性和熱穩(wěn)定性。最終，研究人員進(jìn)一步將PvCel5A變體應(yīng)用在以玉米為原料的一代乙醇和以秸稈為原料的二代乙醇中（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加PvCel5A變體可使乙醇產(chǎn)量增加5.69%-10.08%。
該項(xiàng)研究證明了以工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)狀況為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助的蛋白質(zhì)工程策略（如InSiReP 2.0），可使更多的酶能更好得被應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化、生物催化和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
圖1: InSiReP 2.0的工作流程概述 圖2: PvCel5A變體在乙醇生產(chǎn)應(yīng)用流程及最終乙醇濃度及產(chǎn)率 論文信息 Evolving Robust and Interpretable Enzymes for the Bioethanol Industry Jie Qiao#, Yijie Sheng#, Minghui Wang, Anni Li, Xiujuan Li*, He Huang* 文章的第一作者是南京師范大學(xué)的碩士研究生喬杰、盛義杰。黃和、李秀娟為該論文的通訊作者。 Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202300320
