天然產(chǎn)物是自然界長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，是生物活性物質(zhì)和藥物研發(fā)的源泉。通過(guò)基因工程技術(shù)，將天然產(chǎn)物生物合成基因和基因簇在微生物中異源表達(dá)，在節(jié)約成本，保護(hù)生態(tài)等方面有重大的意義。
多酶復(fù)合物的形成使酶活性位點(diǎn)接近，以促進(jìn)中間代謝物的轉(zhuǎn)移，隔離中間滲漏并簡(jiǎn)化代謝流向所需產(chǎn)物。這里香港中文大學(xué)夏江課題組總結(jié)了幾種在微生物細(xì)胞內(nèi)的多酶復(fù)合物的結(jié)合方式，從靜態(tài)的納米酶結(jié)構(gòu)（有支架或無(wú)支架）到基于液液相分離的動(dòng)態(tài)酶凝聚層。
圖1. 構(gòu)建合成多酶復(fù)合物的三種策略：無(wú)支架、支架支持和相分離。 大多數(shù)天然多酶復(fù)合物并不需要支架，而是以domain-domain相互作用來(lái)組裝成不同的催化單元，例如脂肪酸合酶和聚酮合酶 [1-5]。這些能夠以共價(jià)或非共價(jià)形式結(jié)合的結(jié)構(gòu)域是天然的酶組裝工具箱。如果將這些結(jié)構(gòu)域融合到不影響催化酶活性的位點(diǎn)（通常為末端），催化酶會(huì)自發(fā)組裝，形成無(wú)支架復(fù)合物。受到天然多酶復(fù)合物的啟發(fā)，香港中文大學(xué)夏江課題組利用RIAD和RIDD這對(duì)短肽，將萜類(lèi)化合物蝦青素和番茄紅素合成途徑中的限速步驟催化酶組裝在一起，形成新的催化節(jié)點(diǎn)，將MVA途徑和萜類(lèi)生物合成途徑流線(xiàn)化，在大腸桿菌和釀酒酵母中都實(shí)現(xiàn)了代謝通量的優(yōu)化[6]。 利用蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子作為支架構(gòu)建多酶復(fù)合物是最常見(jiàn)的多酶組裝方式。利用Dueber 等人設(shè)計(jì)的合成蛋白質(zhì)支架，基于蛋白質(zhì)-肽相互作用（基于 SH3、SH2 和 PDZ 結(jié)構(gòu)域）在甲羥戊酸生物合成途徑中組裝了三種順序酶。他們實(shí)現(xiàn)了對(duì)代謝通量的有效控制，使產(chǎn)物效價(jià)提高了77倍[7]。除了線(xiàn)性蛋白質(zhì)支架外，蛋白質(zhì)籠也可用作酶組裝的支架，并且最近在疫苗開(kāi)發(fā)中受到了極大的關(guān)注[8-10]。工程師將酶封裝在籠子內(nèi)，使其與細(xì)胞質(zhì)中其他的代謝途徑隔離開(kāi)來(lái)。巧妙的是，通過(guò)對(duì)籠子的孔徑進(jìn)行微調(diào)，可以控制籠子的穩(wěn)定性和進(jìn)出籠子的分子流量[11-14]。通過(guò)核酸大分子構(gòu)建起來(lái)的有序納米結(jié)構(gòu)支架通常被稱(chēng)為“DNA折紙”[15-16]。Conrado等人使用質(zhì)粒 DNA 作為支架，在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中排列生物合成酶。質(zhì)粒DNA中獨(dú)特的鋅指結(jié)構(gòu)通過(guò)特異性結(jié)合引導(dǎo)酶至DNA模板上，經(jīng)驗(yàn)證，包括白藜蘆醇、1,2-丙二醇和甲羥戊酸在內(nèi)的多種代謝產(chǎn)物的滴度隨著支架結(jié)構(gòu)的增加而增加[17]。 由于天然細(xì)胞器自身的結(jié)構(gòu)和功能具有完整性和獨(dú)立性，利用天然細(xì)胞器封裝多個(gè)酶進(jìn)行組裝引起了科學(xué)家們的廣泛興趣[18-20]。尼爾森等人[18]基于過(guò)氧化物酶體是脂肪酸降解的細(xì)胞器這一認(rèn)識(shí)，將過(guò)氧化物酶體變成了脂肪酸衍生物生產(chǎn)的工廠(chǎng)，使脂肪酸衍生品如脂肪醇、烷烴和烯烴的產(chǎn)量提高到 700%。更值得一提的是，作者增加了過(guò)氧化物酶體數(shù)量，讓產(chǎn)量又進(jìn)一步提高3倍。 基于液液相分離形成的細(xì)胞內(nèi)凝聚體是一種蛋白質(zhì)組裝的新型無(wú)膜細(xì)胞器。在相分離過(guò)程中形成的液滴可以在有限的體積內(nèi)濃縮高達(dá)上百倍濃度的蛋白質(zhì)并同時(shí)保持液體的流動(dòng)性。這一特性賦予了酶催化過(guò)程中的底物，中間產(chǎn)物和輔因子交換迅速的特性，這使得相分離可以在天然產(chǎn)物的生物合成中作為一個(gè)有效的多酶組裝體。例如作者課題組在體外通過(guò)多肽-多肽相互作用將酶引入三蛋白組分（Shank，Homer和GKAP）形成的相分離，成功提升了催化效率[21]?；诖耍髡哒n題組還進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌體內(nèi)單一蛋白（RGGRGG）凝聚體的構(gòu)建，并將萜類(lèi)化合物的生物合成酶組裝到凝聚體內(nèi)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了法呢烯的產(chǎn)量提升[22]。 圖2. 通過(guò)蛋白質(zhì)相分離進(jìn)行多酶組裝 多酶復(fù)合物優(yōu)化了微生物內(nèi)部的代謝通量，提高了產(chǎn)物效價(jià)。盡管如此，用于大規(guī)模生產(chǎn)有價(jià)值化學(xué)品的合成多酶復(fù)合物的工業(yè)應(yīng)用尚未實(shí)現(xiàn)。該領(lǐng)域仍在尋求新的策略來(lái)更好地平衡動(dòng)態(tài)性和限制性，并像天然多酶復(fù)合物一樣更好地控制細(xì)胞中的局部區(qū)室化。 WILEY 參考文獻(xiàn)： [1] K. Singh, B. Graf, A. Linden, V. Sautner, H. Urlaub, K. Tittmann, H. Stark, A. Chari, Cell 2020, 180, 1130-1143. e20. [2] P. Johansson, B. Wiltschi, P. Kumari, B. Kessler, C. Vonrhein, J. Vonck, D. Oesterhelt, M. Grininger, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008, 105, 12803-12808. [3] S. R. Bagde, I. I. Mathews, J. C. Fromme, C.-Y. Kim, Science 2021, 374, 723-729. [4] M. Leibundgut, S. Jenni, C. Frick, N. Ban, Science 2007, 316, 288-290. [5] T. Robbins, Y.-C. Liu, D. E. Cane, C. Khosla, Curr. Opin. Struct. Biol. 2016, 41, 10-18. [6] W. Kang, T. Ma, M. Liu, J. Qu, Z. Liu, H. Zhang, B. Shi, S. Fu, J. Ma, L. T. F. Lai, Nat. Commun. 2019, 10, 1-11. [7] J. E. Dueber, G. C. Wu, G. R. Malmirchegini, T. S. Moon, C. J. Petzold, A. V. Ullal, K. L. Prather, J. D. Keasling, Nat. Biotechnol. 2009, 27, 753-759. [8] S. Chakraborti, T.-Y. Lin, S. Glatt, J. G. Heddle, RSC Adv. 2020, 10, 13293-13301. [9] J.-S. Ra, H.-H. Shin, S. Kang, Y. Do, Clin. Exp. Vaccine Res. 2014, 3, 227-234. [10] T. N. Szyszka, E. N. Jenner, N. Tasneem, Y. H. Lau, ChemSystemsChem 2022, 4, e202100025. [11] I. Stupka, Y. Azuma, A. P. Biela, M. Imamura, S. Scheuring, E. Pyza, O. Wo?nicka, D. P. Maskell, J. G. Heddle, Sci. Adv. 2022, 8, eabj9424. [12] N. Tasneem, T. N. Szyszka, E. N. Jenner, Y. H. Lau, ACS Nano 2022. [13] L. S. Adamson, N. Tasneem, M. P. Andreas, W. Close, E. N. Jenner, T. N. Szyszka, R. Young, L. C. Cheah, A. Norman, H. I. MacDermott-Opeskin, Sci. Adv. 2022, 8, eabl7346. [14] W. M. Aumiller, M. Uchida, T. Douglas, Chem. Soc. Rev. 2018, 47, 3433-3469. [15] T. T?rring, N. V. Voigt, J. Nangreave, H. Yan, K. V. Gothelf, Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 5636-5646. [16] P. Wang, T. A. Meyer, V. Pan, P. K. Dutta, Y. Ke, Chem 2017, 2, 359-382. [17] R. J. Conrado, G. C. Wu, J. T. Boock, H. Xu, S. Y. Chen, T. Lebar, J. Turn?ek, N. Tom?i?, M. Avbelj, R. Gaber, T. Koprivnjak, J. Mori, V. Glavnik, I. Vovk, M. Ben?ina, V. Hodnik, G. Anderluh, J. E. Dueber, R. Jerala, M. P. DeLisa, Nucleic Acids Res. 2011, 40, 1879-1889. [18] Y. J. Zhou, N. A. Buijs, Z. Zhu, D. O. Gomez, A. Boonsombuti, V. Siewers, J. Nielsen, J Am Chem Soc 2016, 138, 15368-15377. [19] J. E. Kim, I. S. Jang, S. H. Son, Y. J. Ko, B. K. Cho, S. C. Kim, J. Y. Lee, Metab Eng 2019, 56, 50-59. [20] K. Thodey, S. Galanie, C. D. Smolke, Nat Chem Biol 2014, 10, 837-44. [21] M. Liu, S. He, L. Cheng, J. Qu, J. Xia, Biomacromolecules 2020, 21, 2391-2399. [22] Y. Wang, M. Liu, Q. Wei, W. Wu, Y. He, J. Gao, R. Zhou, L. Jiang, J. Qu, J. Xia, Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202203909. 論文信息 Synthetic Multienzyme Assemblies for Natural Product Biosynthesis Min Liu, Yue Wang, Hao Jiang, Yongxu Han, Prof.?Dr. Jiang Xia ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.202200518
