近年來，新發(fā)病原體，如新冠病毒、流感病毒、中東呼吸系統(tǒng)綜合征、埃博拉、寨卡等病原微生物對(duì)人類安全造成嚴(yán)重危害。PCR技術(shù)作為應(yīng)對(duì)傳染病防控的金標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)尚面臨耗時(shí)長、依賴于中心實(shí)驗(yàn)室、依賴于專業(yè)技術(shù)人員等一系列應(yīng)用問題。因此，開發(fā)新型核酸檢測技術(shù)用于提高傳染性疾病防控能力是當(dāng)前世界范圍內(nèi)的重要科學(xué)課題。
CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可用來抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。作為近30來最重要的生物技術(shù)之一，CRISPR技術(shù)在基因編輯、分子診斷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在當(dāng)前的研究進(jìn)展中，將CRISPR/Cas識(shí)別和核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合起來是最接近商業(yè)化使用的分子診斷方案。然而，因?yàn)镃RISPR切割會(huì)破壞核酸等溫?cái)U(kuò)增的模板，使得二者在單管、單步的檢測中難以兼容。因此，大多數(shù)報(bào)道的基于CRISPR/Cas的核酸檢測技術(shù)需要將核酸擴(kuò)增過程和CRISPR/Cas檢測過程分步進(jìn)行。但是分步過程會(huì)涉及到反應(yīng)試管的開蓋和液體轉(zhuǎn)移，使得檢測步驟復(fù)雜化。另外，開蓋操作很容易產(chǎn)生氣溶膠污染，導(dǎo)致假陽性。因此，發(fā)展閉管的CRISPR檢測方法是CRISPR分子診斷技術(shù)研究領(lǐng)域中一個(gè)非常關(guān)鍵的問題，也是影響它的商業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵瓶頸。
華南師范大學(xué)周小明課題組在前期曾開發(fā)了一種光控CRISPR技術(shù)來解決這個(gè)問題。在這一光控CRISPR檢測策略中，通過設(shè)計(jì)一種修飾了光可切割連接子（PC-linker）的寡核苷酸與crRNA雜交，阻斷CRISPR系統(tǒng)的識(shí)別和切割功能。光控一管法在時(shí)間維度上分離了核酸擴(kuò)增和CRISPR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了封閉、單管、高靈敏度的核酸檢測（PNAS, 2022, 119, e2202034119）。盡管光控CRISPR診斷技術(shù)的應(yīng)用前景廣闊，但現(xiàn)有的光控版本仍存在應(yīng)用難題。例如，該方法需要優(yōu)化沉默寡核苷酸和crRNA的比例，以實(shí)現(xiàn)crRNA的完全雜交和沉默。這一額外的雜交步驟使檢測過程和未來凍干試劑的構(gòu)建變得復(fù)雜。此外，基于crRNA雜交的沉默策略將阻止crRNA與Cas蛋白的預(yù)先結(jié)合，從而影響Cas蛋白/crRNA的穩(wěn)定性。因此，迫切需要開發(fā)一種更直接的光控CRISPR檢測方法，以實(shí)現(xiàn)簡化的核酸檢測。
近日，該課題組通過合成6-硝基哌啶氧基甲基（NPOM）修飾的CRISPR-Cas12a crRNA，進(jìn)而開發(fā)了一種新型的光啟動(dòng)CRISPR-Cas12系統(tǒng)。在這一技術(shù)中，NPOM籠化的crRNA可阻止crRNA與靶DNA之間的沃森-克里克堿基配對(duì)，從而沉默CRISPR-Cas12活性。通過UV光誘導(dǎo)crRNA的脫籠化即可實(shí)現(xiàn)快速的活性恢復(fù)。與之前的光控CRISPR檢測方法相比，當(dāng)前的光啟動(dòng)策略有助于開發(fā)更加穩(wěn)健的一管式CRISPR檢測方法，具有更簡單（使用與常規(guī)CRISPR檢測相同的試劑制備流程）、更快（無需RNA雜交步驟）、更穩(wěn)定（籠化crRNA不影響其與Cas12a的預(yù)先結(jié)合，從而提高試劑的穩(wěn)定性）和更低成本（只需要一條籠化crRNA）的特點(diǎn)。
在對(duì)人類皰疹病毒EBV DNA樣本和SARS-CoV-2 RNA樣本的分析中，本研究方法展現(xiàn)出極快的檢測速度，這表明該方法在核酸的臨床快速檢測中具有巨大潛力。此外，作者所展示其開發(fā)的便攜式光控CRISPR檢測裝置，進(jìn)一步證明了光控一管法的自動(dòng)化發(fā)展前景。這一進(jìn)展將有望加速推進(jìn)CRISPR分子診斷技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品安全等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。 論文信息 Light-Start CRISPR?Cas12a Reaction with Caged crRNA Enables Rapid and Sensitive Nucleic Acid Detection Menglu Hu#, Ruhan Liu#, Zhiqiang Qiu, Feng Cao, Tian Tian, Yunxin Lu, Yongzhong Jiang, and Xiaoming Zhou* 博士研究生胡夢露，碩士研究生劉儒汗為該研究論文的共同第一作者，周小明研究員為通訊作者。 Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202300663
