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三尖杉烷型二萜(Cephalotane-type diterpenoids)僅存在于生長緩慢的三尖杉屬(Cephalotaxus)植物中，是一類結(jié)構(gòu)獨特且復(fù)雜多樣、具剛性多環(huán)系多手性中心的二萜類化合物，在生源上它們可能均來自于具6/6/5/7環(huán)系的共同二萜烯前體。上世紀70年代末發(fā)現(xiàn)的海南粗榧內(nèi)酯(harringtonolide，hainanolide)是其中最具代表性的化合物，具有多種顯著生物活性，尤其對人KB細胞的IC₅₀值達43 nM，極具研發(fā)前景。但是該類化合物在植物中含量極低，且因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致化學(xué)合成困難，來源受限。生物合成可為解決這一難題提供新策略，然而，有關(guān)三尖杉烷型二萜生物合成研究未見報道，其二萜烯骨架、二萜合酶及其環(huán)化機制仍是謎團。

近日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所戴均貴教授團隊在國際著名期刊Angew. Chem. 上在線發(fā)表了關(guān)于三尖杉烷型二萜生物合成的相關(guān)研究成果。該研究首次明確了三尖杉烷型二萜前體為三尖杉烯(1，cephalotene)，發(fā)現(xiàn)并功能鑒定了三尖杉烯合酶CsCTS，闡明了其環(huán)化機制。

作者從粗榧(C. sinensis)中發(fā)現(xiàn)了一個I型二萜合酶能夠產(chǎn)生一個主產(chǎn)物1和四個脫軌產(chǎn)物(M1?M4)，經(jīng)NMR、化學(xué)衍生和X-射線單晶衍射分析確定了主產(chǎn)物1的結(jié)構(gòu)為三尖杉烯，從而鑒定了該酶的功能，命名為三尖杉烯合酶CsCTS (Cephalotaxus sinensis Cephalotene Synthase)。

為闡明CsCTS催化機制，作者鑒定了脫軌產(chǎn)物M1?M4的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)M1和M2是紫杉二烯合酶TbTS環(huán)化中前兩步反應(yīng)的碳正離子脫質(zhì)子產(chǎn)物，結(jié)合生物信息學(xué)分析及CsCTS催化特性，提出了三種可能的環(huán)化機制(pathways i?iii)。

進一步經(jīng)同位素標(biāo)記實驗證明了所提出的環(huán)化機制中關(guān)鍵的氫遷移、甲基遷移和環(huán)化反應(yīng)，結(jié)合密度泛函理論計算，闡明了CsCTS通過pathway i環(huán)化機制催化形成cephalotene。

作者進一步利用分子對接、點突變和分子動力學(xué)模擬揭示了CsCTS中負責(zé)碳正離子級聯(lián)反應(yīng)的兩個關(guān)鍵氨基酸殘基(W756和F613)，其中W756負責(zé)穩(wěn)定A⁺、F613負責(zé)碳正離子B⁺到D⁺的1,2-H-遷移和1,2-甲基遷移。有趣的是，通過序列比對、活性中心結(jié)構(gòu)分析及相互突變，發(fā)現(xiàn)突變體CsCTS F613 V/I無三尖杉烯形成活性，但可生成少量的紫杉二烯；而紫杉二烯合酶突變體TbTS V610F無紫杉二烯形成活性，但可生成少量的三尖杉烯。這些結(jié)果提示：同源性相近的CsCTS/TbTS可能起源于同一祖先，賦予其前期環(huán)化機制的相似性；同時，在演化過程中關(guān)鍵氨基酸殘基(F613/V610)的突變導(dǎo)致其環(huán)化機制出現(xiàn)分歧，進化出功能分支的二萜合酶，從而形成了種屬特異性的代謝產(chǎn)物，顯示了自然界中植物-基因/酶-途徑-代謝產(chǎn)物之間的演化關(guān)聯(lián)性。

該研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了三尖杉烷型二萜生物合成第一步反應(yīng)相關(guān)二萜合酶，闡明了其催化機制，為破譯和人工構(gòu)建三尖杉烷型二萜生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。