圖1 本項工作示意圖 在生物大分子的結(jié)構(gòu)和相互作用研究中，尤其當(dāng)利用順磁核磁共振和電子順磁共振等技術(shù)時，氮氧自由基作為順磁探針的一種，已經(jīng)得到廣泛而有效的應(yīng)用。與其他種類的順磁探針相比，氮氧自由基的結(jié)構(gòu)更小，勢必會減少由于探針連接對于待測生物大分子三維結(jié)構(gòu)的影響。為了更加反映出待測分子的真實生理狀態(tài)，目前結(jié)構(gòu)生物學(xué)更加注重生物大分子在其近似細胞內(nèi)環(huán)境（或細胞內(nèi)環(huán)境）的結(jié)構(gòu)研究。但是，氮氧自由基甚至在細胞裂解液里的不穩(wěn)定性極大的限制了其應(yīng)用。 基于此，南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院蘇循成和楊茵團隊根據(jù)其課題組活細胞磁共振研究中的發(fā)現(xiàn)，提出通過Michael受體之一的馬來酰亞胺提高氮氧自由基在細胞裂解液中的穩(wěn)定性，以此把NO自由基標記物拓展到細胞裂解液研究中。馬來酰亞胺的加入并沒有破壞細胞裂解液的擁擠程度，因此可以很好的模擬細胞內(nèi)的環(huán)境，這一點通過電子共振實驗得到了證實。 在之前的研究中，氮氧自由基在細胞內(nèi)環(huán)境的猝滅通常歸因于谷胱甘肽（GSH）和抗壞血酸（Ascorbic）等小分子還原性物質(zhì)的作用。本項工作系統(tǒng)研究了常見的還原劑（如GSH, Ascorbic, DTT, TCEP, NADPH,NADH）對于氮氧自由基（MTSL, M-Prox, M-TETPO）穩(wěn)定性的影響。在以上實驗中，氮氧自由基大多保持了很好的穩(wěn)定性，尤其是四乙基氮氧自由基（M-TETPO）。這說明以上還原劑均不是或不單獨是細胞環(huán)境猝滅氮氧自由基的原因。 圖2 (A-C)氮氧自由基在大腸桿菌(E. coli)裂解液，人宮頸癌細胞(HeLa)裂解液和人胚胎腎細胞(HEK293T)裂解液中的穩(wěn)定性（D-E）加入不同濃度的馬來酰亞胺后，氮氧自由基(M-Prox)在上述裂解液中的穩(wěn)定性 與細胞裂解液中氮氧自由基的不穩(wěn)定相比，如果利用超濾的方式移除細胞裂解液的小分子或者將細胞裂解液加熱處理后，氮氧自由基的穩(wěn)定性得到了很大的提升，但是這兩種方法破壞了細胞裂解液的原有成分，故不適用細胞環(huán)境的模擬。有趣的是，在移除小分子之后的裂解液中，如果重新補加NAD(P)H，氮氧自由基會重新變得不穩(wěn)定，但是重新補加GSH卻沒有此現(xiàn)象。這說明氮氧自由基在細胞裂解液中的猝滅可能是由大分子（如相關(guān)酶）和NAD(P)H共同作用的結(jié)果。而基于之前的研究（C. Y. Cui et al. ACS Cent Sci, 2023）,Michael受體可以在細胞內(nèi)被還原，研究人員利用一種最常見的Michael受體馬來酰亞胺來處理細胞裂解液，在此裂解液中，氮氧自由基可以在室溫維持4小時以上的穩(wěn)定性。并且通過相關(guān)的核磁實驗，證實了馬來酰亞胺的還原消耗了細胞內(nèi)的NAD(P)H，從而保持了細胞裂解液中氮氧自由基的穩(wěn)定。最后，研究人員利用兩種模式蛋白質(zhì)，人泛素蛋白（ubiquitin）和鏈球菌G蛋白B1免疫球蛋白結(jié)合域（GB1），通過雙電子共振實驗，得到了與之前報道的相關(guān)蛋白細胞內(nèi)實驗類似的結(jié)果，從而證明了馬來酰亞胺處理的裂解液可以模擬細胞環(huán)境。 改工作可以拓展NO自由基標記的大分子研究到細胞裂解液環(huán)境中，在近似細胞環(huán)境中探究大分子動態(tài)、互作與結(jié)構(gòu)研究。由于馬來酰亞胺對于活細胞具有毒性，因此發(fā)展活細胞內(nèi)氮氧自由基探針的應(yīng)用還需要未來更多的研究。 論文信息 Stabilizing Nitroxide Spin Labels for Structural and Conformational Studies of Biomolecules by Maleimide Treatment Xi-Wei Wang, Xing Zhang, Chao-Yu Cui, Bin Li, Prof. Daniella Goldfarb, Prof. Yin Yang, Prof. Xun-Cheng Su 文章中王溪偉和張興為共同第一作者，通訊作者為南開大學(xué)元素有機化學(xué)國家重點實驗室蘇循成教授和楊茵研究員 Chemistry – A European Journal DOI: 10.1002/chem.202301350
