RNA上存在超過170 種化學(xué)修飾，其中N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，簡稱為m6A）是真核RNA中最常見的一種。在哺乳細(xì)胞中， METTL3，METTL14，WTAP等催化形成m6A，F(xiàn)TO和ALKBH5負(fù)責(zé)擦除m6A，YTH和HNRNP蛋白家族則識別m6A以發(fā)揮其功能。據(jù)報道，m6A參與調(diào)控RNA性質(zhì)，從而影響細(xì)胞內(nèi)生物活動，并且與眾多疾病息息相關(guān)。然而由于m6A的作用依賴于其生物環(huán)境，即同一條RNA上不同位置的m6A，不同RNA/細(xì)胞/組織中的m6A發(fā)揮的作用可能截然不同，因此開發(fā)可精準(zhǔn)編輯m6A的工具對解析特定m6A的功能至關(guān)重要。
為此，可特異性結(jié)合RNA的CRISPR Cas13系統(tǒng)被用來構(gòu)建新型的m6A編輯器，但大部分基于Cas13的編輯器一經(jīng)表達(dá)后就會開始m6A編輯，這一過程缺乏可控性，存在潛在脫靶的安全隱患。并且體積較大的Cas13蛋白與RNA結(jié)合可能會產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)而對RNA自身產(chǎn)生干擾。因此，實現(xiàn)對基于Cas13的 m6A編輯器的劑量濃度和時間控制，有望能解決這些潛在問題。
近日，美國凱斯西儲大學(xué)Fu-Sen Liang教授團隊提出了一種新的策略，利用依賴Shield-1小分子的FKBP (F36V, L106P)突變體（簡稱FKBP*），與他們之前開發(fā)的dCas13b-ALK（66-286 aa of ALKBH5）進(jìn)行聯(lián)合，構(gòu)建了一種穩(wěn)定性可控的CRISPR-Cas13b編輯器（稱為FKBP*-dCas13b-ALK），用于精準(zhǔn)的m6A RNA甲基化擦除。
首先，作者通過蛋白質(zhì)印記法證實了FKBP*-dCas13b-ALK在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量可以通過控制Shield-1濃度和處理時間來調(diào)節(jié)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，僅用Shield-1處理細(xì)胞后，F(xiàn)KBP*-dCas13b-ALK才能特異性地被招募到目標(biāo)RNA，如Malat1 lncRNA上的 m6A 靶點附近，并精準(zhǔn)降低該靶點上的m6A水平，而不影響遠(yuǎn)端的非靶點腺嘌呤和其他RNA上可被編輯腺嘌呤m6A水平。此外，作者還發(fā)現(xiàn)對該靶點的m6A進(jìn)行擦除會降低與RNA結(jié)合的HNRNPC蛋白含量，但不影響其穩(wěn)定性。實驗結(jié)果也表明，該體系對特定RNA上的m6A 靶點編輯受到Shield-1處理時間的調(diào)控。 此外，作者發(fā)現(xiàn)在去除Shield-1后，原本特異性招募的FKBP*-dCas13b-ALK，m6A擦除及其生物效應(yīng)都可被逆轉(zhuǎn)。通過時間進(jìn)程研究，作者發(fā)現(xiàn)招募到目標(biāo)RNA上的FKBP*-dCas13b-ALK會隨著Shield-1去除而迅速減少，在3 h后恢復(fù)到背景水平，并且證實這是由FKBP*-dCas13b-ALK在細(xì)胞內(nèi)的快速降解引起的。盡管該靶點上被降低的m6A水平能在Shield-1去除24 h后完全上調(diào)到到背景水平，但其恢復(fù)速度遠(yuǎn)比融合蛋白從RNA上脫離要慢。這一時間差提供了一個研究m6A而不受融合蛋白干擾的窗口。該體系用于編輯其他RNA 上m6A的普適性也得到驗證。 在該工作中，作者開發(fā)了一種依賴于Shield-1的FKBP*-dCas13b-ALK體系，能廣泛用于實現(xiàn)特定RNA上精準(zhǔn)可逆的m6A擦除。編輯完m6A后，去除Shield-1會導(dǎo)致融合蛋白迅速降解，從而降低其對RNA的干擾，也為在原生環(huán)境下研究m6A提供了合適的時間窗口。這一發(fā)現(xiàn)為深入研究m6A的功能提供了新的方法。 論文信息 Site-Specific m6A Erasing via Conditionally Stabilized CRISPR-Cas13b Editor Ying Xu, Yufan Wang, Fu-Sen Liang Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202309291
