細(xì)胞色素P450單加氧酶是一類以亞鐵血紅素為活性中心的氧化酶超家族，在生物體內(nèi)廣泛參與內(nèi)、外源物質(zhì)的合成與代謝，是極具合成應(yīng)用潛力的多功能的生物氧化催化劑，備受合成化學(xué)以及合成生物學(xué)等領(lǐng)域研究者的關(guān)注。然而細(xì)胞色素P450單加氧酶催化功能的實(shí)現(xiàn)依賴于輔酶NAD(P)H和還原伴侶蛋白，這限制了其在體外的催化應(yīng)用。
針對上述問題，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所叢志奇研究組通過模擬天然過加氧酶(peroxygenase)和過氧化物酶(peroxidase)的催化機(jī)理，設(shè)計(jì)并利用一種雙功能小分子（Dual-functional small molecules, DFSM）——其一端以?；被嶙鳛殄^定基團(tuán)、另一端以咪唑基作為催化基團(tuán)——實(shí)現(xiàn)協(xié)同P450血紅素活性中心協(xié)同活化過氧化氫，將P450單加氧酶改造為過加氧酶體系。近年來，該人工P450過加氧酶體系與蛋白質(zhì)工程完美結(jié)合對多種非天然底物表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性和選擇性。然而其進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用仍然受到一些因素的制約，首先是DFSM對P450的極低親和力導(dǎo)致催化過程中需要超過1000倍投入量；其次是催化基團(tuán)仍僅限于咪唑基。
為此，研究人員通過研究典型DFSM——N-(ω-咪唑基)-脂肪?；?L-苯丙氨酸（Im-C6-Phe）——與P450BM3的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，受到DFSM形成雙重構(gòu)象的啟發(fā)，設(shè)想通過由兩個(gè)氨基酸縮合得到二肽作為錨定基團(tuán)，可能獲得具有高親和性的人工輔助因子，從而構(gòu)建雙中心人工過加氧酶。 作者從合成的73個(gè)二肽分子——N-(ω-咪唑基)-脂肪酰基-L-氨基酸-L-氨基酸（Im-DFSM-dipeps）——當(dāng)中篩選到一系列、親和力最高提升三個(gè)數(shù)量級(jí)的DFSM。親和性（Kd~10-8 M）已十分接近一些天然酶/輔因子，如黃素（FAD、FMN）依賴型酶。使DFSM 相對于P450BM3的負(fù)載量由1000當(dāng)量降低到2當(dāng)量。 P450BM3 F87A突變體與六個(gè)Im-DFSM-dipeps的晶體復(fù)合物解釋了結(jié)合親和力提高的原因，以Im-C6-Phe-Phe為例，它的末端羧基直接與Tyr51、Arg47、Ala72、Gln73和Ala74形成氫鍵，并通過水分子介導(dǎo)氫鍵網(wǎng)絡(luò)與Leu437、Ser72和鐵卟啉末端羧基作用。另外，兩個(gè)芐基殘基分別與由L20、Pro25、Val26、Leu29、Met185和Leu188（黃色）以及Leu17、Leu20、Phe42、Ala44和Arg47（橙色）組成的兩個(gè)疏水口袋結(jié)合。強(qiáng)大的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和疏水作用協(xié)同將Im-C6-Phe-Phe牢固地結(jié)合在酶上，使咪唑基團(tuán)與軸向配位的水分子形成氫鍵并與鐵保持在適當(dāng)?shù)奈恢?。其他晶體復(fù)合物均呈現(xiàn)相似的結(jié)合構(gòu)象。 最后，作者利用吡啶基和胺基取代咪唑作為酸堿催化基團(tuán)合成了兩個(gè)系列的新型二肽雙功能分子，研究發(fā)現(xiàn)吡啶基DFSM和氨基DFSM均顯示出與咪唑基DFSM具有不同的底物偏好性和選擇性。 這項(xiàng)研究提供了一種通過錨定可編輯的輔因子樣模塊作為共催化中心來構(gòu)建雙中心人工過加氧酶的策略，提高了P450酶的催化多功能性。 論文信息 Anchoring a structurally editable proximal cofactor-like module to construct an artificial dual-center peroxygenase Xiangquan Qin, Yiping Jiang, Fuquan Yao, Jie Chen, Fanhui Kong, Panxia Zhao, Longyi Jin, Zhiqi Cong Angewandte Chemie International Edition DOI: 10.1002/anie.202311259
