給大家介紹一片來(lái)自“ACS Chemical Biology”的文章，題名為“Chemoproteomic Profiling of Protein Substrates of a Major Lysine Acetyltransferase in the Native Cellular Context”。
賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶 (KAT) 家族調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)和信號(hào)通路。在這里，作者發(fā)現(xiàn)可點(diǎn)擊的酰基輔酶A報(bào)告基因 3-疊氮基丙酰輔酶A(3AZ-CoA) 在細(xì)胞中呈現(xiàn)出顯著的細(xì)胞滲透性和有效的?；鞍踪|(zhì)。作者合理地設(shè)計(jì)了主要的 KAT 成員組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶 1 (HAT1)，以生成其突變體形式，在底物標(biāo)記中對(duì) 3AZ-CoA 顯示出出色的生物正交活性。作者能夠應(yīng)用生物正交酶-輔因子對(duì)與 SILAC 蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，在活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn) HAT1 底物靶向、富集和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
在分析了 HAT1-Ac-CoA 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)后（圖 2A，），作者推測(cè)活性口袋太窄，無(wú)法容納龐大的?；o酶A?；?。因此，采用凹凸法對(duì) HAT1 的 Ac-CoA 結(jié)合位點(diǎn)附近的殘基進(jìn)行突變，以擴(kuò)大乙酰基周圍的空間（圖1）。作者在 HAT1 的 Ac-CoA 結(jié)合袋中鑒定了七個(gè)大氨基酸殘基。這些殘基中的每一個(gè)都突變?yōu)榭臻g位阻較小的氨基酸，即丙氨酸或甘氨酸（圖2A）。通過(guò)使用pET28a-HAT1質(zhì)粒作為模板，作者使用 QuikChange 定點(diǎn)誘變方案將每個(gè)選定的殘基突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼帷Ｍㄟ^(guò)在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中表達(dá)蛋白并隨后進(jìn)行Ni-NTA親和純化，成功獲得了重組wt-HAT1和不同的eng-HAT1蛋白。wt-HAT1 和 HAT1 突變體的?；D(zhuǎn)移活性通過(guò)使用熒光探針CPM量化副產(chǎn)物 CoA 來(lái)測(cè)量。分別在 392和 482 nm 的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量熒光，數(shù)據(jù)以熱圖格式匯總（圖2B）。最終選擇了 HAT1-Y282A 突變體來(lái)進(jìn)一步檢測(cè) HAT1 的底物。
圖1
圖2
作者通過(guò)使用成像模式檢查組蛋白H4上的標(biāo)記效率來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證 HAT1-Y282A 對(duì)疊氮化物/炔酰基輔酶A輔助因子的活性。這些凝膠內(nèi)成像數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持 HAT1-Y282A 對(duì)酰基輔酶A報(bào)告基因的生物正交活性，并證明使用 HAT1-Y282A 與酰基輔酶A報(bào)告基因配對(duì)識(shí)別和成像 HAT1 細(xì)胞底物的可行性和穩(wěn)健性。
圖3
接下來(lái)，作者研究潛在的細(xì)胞滲透性?；o酶A報(bào)告基因，這些報(bào)告基因可用于分析活細(xì)胞中的 HAT1 底物。作者對(duì)一組含疊氮化物或炔烴的短鏈脂肪酸和?；o酶 A 報(bào)告基因進(jìn)行了比較研究，以評(píng)估它們的細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞蛋白標(biāo)記敏感性。在所有測(cè)試的化合物中，3AZ-CoA 顯示出最強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)標(biāo)記（圖4B)。結(jié)果表明 3AZ-CoA 有可能作為 KAT 底物標(biāo)記的細(xì)胞滲透性生物正交報(bào)告基因。
圖4
為進(jìn)一步了解 3AZ-CoA 對(duì)細(xì)胞蛋白的標(biāo)記，對(duì) HEK293T 細(xì)胞進(jìn)行了 3AZ-CoA 劑量依賴性處理。該結(jié)果再次支持 3AZ-CoA 作為 KAT 的生物正交報(bào)告基因具有出色的細(xì)胞滲透性。接下來(lái)，作者試圖測(cè)試 3AZ-CoA 作為細(xì)胞滲透報(bào)告基因在不同類型細(xì)胞系中的普遍性。HeLa 細(xì)胞、HCT 116 細(xì)胞和 MEF 細(xì)胞用于檢測(cè)細(xì)胞蛋白標(biāo)記（圖 4D)?？傊袛?shù)據(jù)證明了 3AZ-CoA 作為 KAT 底物標(biāo)記的細(xì)胞滲透性報(bào)告基因的能力。
作者隨后研究了 HAT1-Y282A 與 3AZ-CoA 匹配是否可以在原生細(xì)胞環(huán)境下標(biāo)記 HAT1 底物。首先，HEK293T 細(xì)胞用表達(dá)載體 pReceiver-M11中的全長(zhǎng) HAT1-Y282A 質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。孵育 36 小時(shí)以允許細(xì)胞表達(dá)突變體 HAT1 后，用 2.5 mM 3AZ-CoA 處理細(xì)胞并再生長(zhǎng) 12 小時(shí)。然后裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞裂解物以通過(guò) CuAAC 反應(yīng)與炔烴-生物素綴合。接下來(lái)，生物素化蛋白通過(guò)鏈霉親和素-HRP 可視化（圖 5B)。結(jié)果表明HAT1 工程策略與其可滲透細(xì)胞的生物正交報(bào)告基因配對(duì)對(duì)于底物標(biāo)記和從天然細(xì)胞環(huán)境中識(shí)別非常有效。
圖5
為了在其天然細(xì)胞環(huán)境中發(fā)現(xiàn) HAT1 底物，作者采用了定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)策略，通過(guò)使用細(xì)胞培養(yǎng)物中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記 (SILAC) 結(jié)合高分辨率質(zhì)譜法。工作流程如圖 6A 所示。在標(biāo)記的蛋白質(zhì)中鑒定出組蛋白 H4，即 HAT1 可以在賴氨酸殘基 5和12乙酰化組蛋白 H4。通過(guò) HAT1 敲除從胚胎成纖維細(xì)胞中鑒定出 65 種蛋白質(zhì)，并使用基于抗體的富集來(lái)捕獲依賴于 HAT1 的乙?；鞍踪|(zhì)。作者發(fā)現(xiàn) 65 種蛋白質(zhì)中有 12 種完全相同或?qū)儆谕患易?，包?H4、H2A、H2B、TPR、PPP2R2A、HSD17B、HMG、HSP、DDX、ATP6V、hnRNP 和 NCL（圖 7B)。作者使用 DAVID 網(wǎng)絡(luò)工具對(duì) 123 個(gè) HAT1 底物進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。HAT1 底物的基因本體分析表明，HAT1 參與過(guò)多的細(xì)胞通路，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA 剪接、RNA 加工、蛋白質(zhì)折疊、氧化還原過(guò)程、線粒體調(diào)節(jié)等（圖 7C）。作者還對(duì) HAT1 底物進(jìn)行了細(xì)胞定位分析（圖 7E）。發(fā)現(xiàn) 49 個(gè) HAT1 底物位于細(xì)胞核中，39 個(gè)位于胞質(zhì)溶膠中，27 個(gè)分布于線粒體中，其中一些重疊。因此，HAT1 的功能顯然超越了細(xì)胞核處理?？偟膩?lái)說(shuō)，這些功能注釋表明 HAT1 底物廣泛分布于細(xì)胞調(diào)節(jié)，這進(jìn)一步證明 HAT1 不僅參與組蛋白修飾和染色質(zhì)調(diào)節(jié)，還參與許多其他重要的細(xì)胞生物學(xué)功能。
圖6
總之，作者已經(jīng)建立了一種生物正交蛋白質(zhì)組學(xué)方法，可以快速可靠地檢測(cè)活細(xì)胞中單個(gè) KAT 的蛋白質(zhì)底物。生成了的HAT1 突變體（例如，HAT1-Y282A）可以容納可點(diǎn)擊的?；o酶 A 報(bào)告基因以進(jìn)行底物標(biāo)記。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn) 3AZ-CoA 是一種可滲透細(xì)胞的蛋白質(zhì)酰化生物正交報(bào)告基因。將 KAT-?；o酶 A 生物正交標(biāo)記對(duì)與 SILAC 蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合在一起，作者成功地在天然細(xì)胞環(huán)境中分析了 100 多種 HAT1 底物。HAT1 靶向眾多非組蛋白細(xì)胞蛋白底物的這一發(fā)現(xiàn)極大地拓寬了 HAT1 調(diào)節(jié)的生物模式的范圍，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了染色質(zhì)領(lǐng)域。
本文作者：QHJ
責(zé)任編輯：FJY
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00935
DOI: 10.1021/acschembio.1c00935
