分享的是一篇發(fā)表在JACS上的文章，文章題目為“Bifunctional Small Molecules That Induce Nuclear Localization and Targeted Transcriptional Regulation”。本文的通訊作者是來自哈佛大學(xué)Broad Institute的Matthew Meyerson教授，其團(tuán)隊致力于使用基因組學(xué)的方法來探索人類疾病的產(chǎn)生原因。
細(xì)胞將其組成成分劃分至不同的區(qū)室以調(diào)節(jié)信息傳遞并濃縮生物分子。真核細(xì)胞具有兩個主要的區(qū)室：胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞核。蛋白質(zhì)在核膜上的運輸主要有兩種方式，被動運輸和主動運輸（當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)小于90 kDa時）。最近的研究進(jìn)一步強調(diào)了蛋白質(zhì)空間定位的重要性，相分離生物分子凝聚物的發(fā)現(xiàn)及其多種功能證明了這一點。蛋白質(zhì)在不同區(qū)室間的易位是一些生物級聯(lián)反應(yīng)中的決定性事件。例如，細(xì)胞色素c從線粒體膜間隙釋放到胞質(zhì)溶膠以啟動細(xì)胞凋亡，或者相反，將 eIF2α 隔離到無膜應(yīng)激顆粒中以暫停翻譯，從而促進(jìn)應(yīng)激條件下的細(xì)胞存活。 核運輸通常是一個強有力的信號事件。許多轉(zhuǎn)錄因子通常存在于胞質(zhì)溶膠中，但在激活后易位到細(xì)胞核。這些轉(zhuǎn)錄因子包括 FoxO、STAT 和核激素受體蛋白家族。 鑒于可替代蛋白質(zhì)定位影響的多種生物過程，作者試圖開發(fā)可以控制蛋白質(zhì)定位的分子。作者假設(shè)化學(xué)誘導(dǎo)的鄰近可用于誘導(dǎo)通常存在于相對區(qū)室中的蛋白質(zhì)的共定位，從而將一個蛋白質(zhì)從其正常位置轉(zhuǎn)移到新位置。早期的研究借助FKBP/FRB系統(tǒng)以改變蛋白質(zhì)的定位。這些研究表明，蛋白質(zhì)可以被募集到細(xì)胞核或質(zhì)膜中，但需要在兩種蛋白質(zhì)上附加可配體標(biāo)簽以及強定位信號，例如SV40 NLS或豆蔻酰化信號。這些研究要么使用了非常強大的天然產(chǎn)物，如雷帕霉素，要么使用了類藥物較少的天然產(chǎn)物復(fù)合物，如FK506和環(huán)孢菌素A。作者旨在探索雙功能化合物是否可以在不使用雙標(biāo)記系統(tǒng)的情況下，通過結(jié)合內(nèi)源性蛋白質(zhì) BRD4來移動蛋白質(zhì)。 作者揭示了能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)從胞質(zhì)溶膠易位到細(xì)胞核的雙功能小分子。這些分子可能在人類健康中具有重要應(yīng)用，例如癌癥治療等。 首先，作者設(shè)計并合成了雙功能小分子AP1867-PEG2-JQ1(NICE-01)，并驗證了化學(xué)誘導(dǎo)的BRD4鄰近能夠迅速誘導(dǎo)靶蛋白的核定位。 BET 溴結(jié)構(gòu)域蛋白家族（BRD2、BRD3、BRD4 和 BRDT）的成員在細(xì)胞內(nèi)豐度較高，具有核定位，且都是(+)-JQ1的高親和力靶標(biāo)?；诖耍髡咴O(shè)計了一種由JQ1和AP1867組成的雙功能分子，其中，AP1867是FKBPF36V的高親和力配體。作者將該分子命名為NICE-01（Nuclear Import and Control of Expression compound 1）（圖1b）。 圖1. 通過 AP1867-PEG2-JQ1（NICE-01）將 GFP 快速導(dǎo)入細(xì)胞核
FKBPF36V-mEGFP和mCherry-BRD4共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示，加入NICE-01（200 nM，40 min）后，FKBPF36V-mEGFP快速易位至細(xì)胞核（圖1c）。直接加入AP1867和 JQ1無法誘導(dǎo)這種效應(yīng)。隨后，作者假設(shè)內(nèi)源性含BET的蛋白質(zhì)可以用作核輸入的“載體”。在穩(wěn)定表達(dá)FKBPF36V-mEGFP的細(xì)胞中，NICE-01（250 nM，3 h）在細(xì)胞核中富集mEGFP（圖1）。這種效應(yīng)可以通過高濃度的JQ1或AP1867（10 μM，圖1e）進(jìn)行補充。
與分子膠相反，雙功能化合物的一個決定性特征是觀察到劑量反應(yīng)在非常高的化合物濃度下降低，稱為“鉤效應(yīng)”。在缺乏外源性 mCherry-BRD4 的細(xì)胞中，10 μM NICE-01 無法誘導(dǎo)FKBPF36V-mEGFP的核輸入。然而，該劑量下，轉(zhuǎn)染mCherry-BRD4 能夠發(fā)生核輸入。這些數(shù)據(jù)與理論預(yù)測一致，在給定濃度的化合物下，三元復(fù)合物形成的減少可以通過進(jìn)一步添加復(fù)合物中存在的蛋白質(zhì)來緩解，該蛋白質(zhì)在復(fù)合物中的存在是限速的(圖1f）。
最近的研究強調(diào)了參與三元復(fù)合物形成的蛋白質(zhì)的化學(xué)計量對雙功能分子生物活性的重要性。作者還發(fā)現(xiàn)，三元配合物組分的化學(xué)計量是核輸入的關(guān)鍵。事實上，實驗觀察到較弱的FKBPF36V-mEGFP導(dǎo)入時依賴于內(nèi)源性含BET的蛋白質(zhì)，缺乏mEGFP胞質(zhì)排斥（圖1g），這可能與通過瞬時轉(zhuǎn)染獲得的異常高的蛋白水平有關(guān)。這一觀察結(jié)果表明，核輸入的細(xì)胞特異性在數(shù)量上受到核定位載體表達(dá)的影響。
mEGFP核輸入可能通過兩種機制發(fā)生。一種為，在存在雙功能分子的情況下，目標(biāo)蛋白可能與BRD4共輸入，就像沒有NLS的較小介質(zhì)復(fù)合亞基“搭載”較大的含有NLS的亞基一樣。另一種可能的機制為，目標(biāo)蛋白質(zhì)可能被動地擴散到核孔中，在這種情況下，雙功能分子通過用BRD4隔離核部分將平衡向核輸入轉(zhuǎn)移，從而防止輸出（“核捕獲”）。
此外，作者還探究了靶蛋白的尺寸對于核易位的影響并計算了蛋白質(zhì)易位時在核膜上的擴散動力學(xué)參數(shù)，構(gòu)建了相關(guān)的模型（圖S1）。 圖 S1. 雙功能分子NICE-01處理細(xì)胞后核輸入的動力學(xué)參數(shù) 隨后，作者探究了NICE-01的生理學(xué)應(yīng)用，表明該雙功能化合物可糾正癌癥相關(guān)核磷蛋白的定位并改變核凝聚物。 急性髓性白血病最常見的亞型是由NPM1基因的雜合突變定義的，這種突變導(dǎo)致其異常的細(xì)胞質(zhì)定位(NPM1c)。NPM1的突變僅發(fā)生在該蛋白的C端，并誘導(dǎo)移碼，同時消除核定位信號并引入核輸出信號(NES)。neo-NES導(dǎo)致輸出蛋白1 (XPO1, CRM1)結(jié)合并從細(xì)胞核輸出蛋白質(zhì)，當(dāng)NPM1c與野生型NPM1寡聚時，以顯性負(fù)性方式將蛋白質(zhì)定位平衡轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕ㄎ辉诩?xì)胞質(zhì)中。先前的研究表明，將細(xì)胞質(zhì)突變體NPM1c重新易位到細(xì)胞核中可以減少HOX基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)白血病分化和細(xì)胞死亡。
圖2. 加入雙功能分子 NICE-01 后，胞質(zhì)定位的 NPM1c被導(dǎo)入核 BRD4 凝聚物中
