分享一篇發(fā)表在 JACS 上的文章，題目為“CytoDirect: A Nucleic Acid Nanodevice for Specific and Efficient Delivery of Functional Payloads to the Cytoplasm”。
將化療藥物、siRNA或小分子抑制劑等功能性有效載荷直接有效地遞送到細(xì)胞質(zhì)中，繞過內(nèi)切酶/溶酶體捕獲，是胞內(nèi)遞藥的一項(xiàng)挑戰(zhàn)性任務(wù)。本文章中，作者利用DNA納米技術(shù)的可編程性開發(fā)了一種名為CytoDirect的DNA納米裝置，該裝置將二硫單元和人類表皮生長因子受體2 (HER2)的粘附體整合到DNA折紙納米結(jié)構(gòu)中，使細(xì)胞質(zhì)快速攝取到靶向癌細(xì)胞并滲透到深層組織中。作者進(jìn)一步證明了治療性寡核苷酸和小分子化療藥物可以很容易地通過CytoDirect傳遞，并分別對基因敲低和細(xì)胞凋亡有顯著的影響。本研究證明了二硫化物和HER2修飾對DNA折紙及其有效載荷到靶細(xì)胞和深部組織的快速胞質(zhì)遞送的協(xié)同作用，從而擴(kuò)大了DNA納米結(jié)構(gòu)的遞送能力，為疾病治療開辟了新的方向。
首先，作者合成了一個(gè)由7249個(gè)核苷酸組成的尺寸為90 nm × 60 nm × 2 nm的DNA折紙納米片DON，通過引入了適當(dāng)?shù)膬?nèi)曲率使納米片彎折來讓藥物更好地裝載于納米片內(nèi)側(cè)。作者使用亞磷酰胺化學(xué)在單鏈DNA的5’端引入了6個(gè)重復(fù)序列的側(cè)鏈含二硫化叔丁基(6SS)的聚磷酸酯，命名為6SS-DNA；作者合成了一段5’端含氨基修飾的單鏈DNA，通過胺-巰基交聯(lián)劑Sulfo-SMCC將含有巰基的HER2親和體與單鏈DNA偶聯(lián)，得到affibody-DNA，在體系中引入HER2親和體。6SS-DNA與affibody-DNA通過與DON上的懸掛DNA單鏈互補(bǔ)配對從而同時(shí)負(fù)載上。最終，TEM結(jié)果表明（圖2c），大多數(shù)don呈矩形形態(tài)，約15%呈管狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)過二硫修飾后，由于叔丁基保護(hù)基團(tuán)在DON的二硫基團(tuán)上引入的疏水效應(yīng)，所有DON都呈現(xiàn)管狀形狀。這種形態(tài)可以在一定程度上保護(hù)管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的有效載荷，疏水效應(yīng)也可以通過增加細(xì)胞膜和CytoDirect之間的相互作用來增強(qiáng)細(xì)胞攝取。
圖2.CytoDirect DNA納米載體的設(shè)計(jì)與表征
接下來，作者利用表達(dá)不同水平HER2蛋白的乳腺癌細(xì)胞系（SK-BR-3和MCF-7，分別為HER2陽性和陰性）來研究CytoDirect的靶向能力。利用熒光素（FAM）標(biāo)記了DON，以跟蹤其位置。結(jié)果表明，當(dāng)每個(gè)DNA折紙上負(fù)載約3個(gè)HER2親和體后，可靶向HER2過表達(dá)細(xì)胞，并且與是否含二硫結(jié)構(gòu)無關(guān)（圖3a）。只有HER2親和體修飾的DNA折紙HAF-DON和CytoDirect都可以靶向SK-BR-3，但是無法與MCF-7結(jié)合。而僅二硫修飾的DS-DON難以與SK-BR-3和MCF-7結(jié)合（圖3b、3c）。
圖3.CytoDirect靶向遞送
接著，作者使用CLSM和流式細(xì)胞術(shù)定性和定量地證明了CytoDirect細(xì)胞攝取效率。CytoDirect會(huì)隨著孵育時(shí)間延長而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而未修飾二硫的DNA折紙HAF-DON則只會(huì)黏附在細(xì)胞表面（圖a）。并且CytoDirect在進(jìn)入細(xì)胞后，熒光分布均勻，表明載體不容易被溶酶體捕獲（圖4a）。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，FAM是標(biāo)記在6SS-DNA上，為了證明是整個(gè)納米載體被細(xì)胞攝取，而不是僅6SS-DNA被攝取，作者用Alexa Fluor 647標(biāo)記了DNA折紙的其他Staple鏈（圖4b），結(jié)果與之前一致，表明CytoDirect具有更高的細(xì)胞攝取效率。二硫修飾和HER2粘附體協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)攝取，細(xì)胞攝取的改善歸因于靶誘導(dǎo)的加速二硫交換反應(yīng)。因此，作者推測了CytoDirect細(xì)胞攝取具有四階段：第一階段:靶向HER2蛋白與表面膜結(jié)合;第二階段:鄰近誘導(dǎo)的有效二硫交換;第三階段:直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì);第四階段:谷氨酰胺輔助納米載體從細(xì)胞膜釋放（圖4c）。
圖4.CytoDirect細(xì)胞攝取
另外，作者檢測了不同修飾的FAM標(biāo)記DNA納米載體的細(xì)胞分布來確定CytoDirect的細(xì)胞攝取方式。SK-BR-3細(xì)胞經(jīng)3 nM CytoDirect、HAF-DON和DS-DON(綠色)處理5小時(shí)后通過共聚焦顯微鏡觀察（圖5）。細(xì)胞核用Hoechst 33342
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