分享一篇近期發(fā)表在ACS Omega上的研究進(jìn)展，題為Construction of Peptide-Lipoic Acid Cationic Polymers with Redox Responsiveness and Low Toxicity for Gene Delivery。這篇文章的通訊作者是四川大學(xué)的Hui Zhao和Kang Wang。
基因療法是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償缺陷和異?；蛞鸬募膊亩_(dá)到治療目的，并且目前已成為最有前途的癌癥治療方法。然而，作為一種帶負(fù)電荷的大分子，核酸很難自行進(jìn)入細(xì)胞以及逃逸核酸酶降解，因此需要基因載體協(xié)助遞送，主要分為病毒載體和非病毒載體兩類。其中，部分病毒載體雖然具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、表達(dá)穩(wěn)定以及細(xì)胞靶向特異性等優(yōu)點(diǎn)，但是仍然面臨生產(chǎn)成本高、基因載量低和免疫原性高等問(wèn)題，這嚴(yán)重限制了其發(fā)展。相比之下，以陽(yáng)離子聚合物為代表的非病毒載體因免疫原性低、可重復(fù)遞送和結(jié)構(gòu)靈活易改性等特點(diǎn)而備受關(guān)注，包括聚乙烯亞胺(PEI)、聚氨酯(PAMAM)和聚丙烯亞胺(PPI)。然而，這些聚合物中大多數(shù)表現(xiàn)出高細(xì)胞毒性、極低的轉(zhuǎn)染效率和高血液凝固風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重制約了陽(yáng)離子聚合物基因載體的臨床應(yīng)用。 已有研究表明，提高基因載體的生物相容性可以非常有效地降低其細(xì)胞毒性，使其成為一種更安全有效的遞送方法。目前，帶正電的氨基酸，如精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)表現(xiàn)出巨大的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物遞送潛力。另外，硫辛酸及其聚合物表現(xiàn)出良好的生物安全性和刺激響應(yīng)性，同樣在藥物和基因遞送方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本文中，作者構(gòu)建了一種基于多肽-硫辛酸的陽(yáng)離子聚合物，其中的二硫鍵可以響應(yīng)腫瘤細(xì)胞中的谷胱甘肽(GSH)實(shí)現(xiàn)快速降解并釋放所攜帶的基因(圖1)。此外，作者還通過(guò)調(diào)整側(cè)鏈序列賦予聚合物不同功能，從而制備出多種聚合物功能材料。圖1. 多肽-硫辛酸聚合物制備以及形成納米聚集體的示意圖 如圖2所示，為獲得低毒且易于降解釋放基因的多肽-硫辛酸陽(yáng)離子聚合物，作者通過(guò)固相合成方法得到了多肽修飾硫辛酸單體M1-M3，進(jìn)而成功制備了結(jié)構(gòu)可調(diào)的陽(yáng)離子聚合物P1-P3。其中，引入Lys是為使聚合物帶正電荷，引入甘氨酸(Gly)是為降低聚合物分子的空間位阻以提高其對(duì)不同空間構(gòu)象的適應(yīng)性，而引入亮氨酸(Leu)則是為阻斷側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)規(guī)律性從而防止聚合物直接在水溶液中自組裝。圖2. 多肽修飾的硫辛酸單體結(jié)構(gòu)式與聚合-降解示意圖 陽(yáng)離子聚合物有效結(jié)合和釋放核酸的能力對(duì)于基因遞送非常重要。作者通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(AGE)評(píng)估了聚合物的基因結(jié)合能力。如圖3A-C所示，結(jié)果表明，P1捕獲DNA的能力有限，而當(dāng)w/w(聚合物/DNA質(zhì)量比)達(dá)到16/1，P2和P3都成功捕獲了具有不同堿基對(duì)的基因，且P3的捕獲效果更好。而將復(fù)合物再暴露于10 mM谷胱甘肽(GSH)溶液中后，AGE測(cè)試結(jié)果表明GSH在一定程度上增強(qiáng)了P2和P3釋放DNA的能力(圖2D-I)。總的來(lái)說(shuō)，P1的DNA負(fù)載能力最差，P3最強(qiáng)但是釋放能力一般，而P2則相對(duì)在DNA負(fù)載與釋放方面都表現(xiàn)出優(yōu)異結(jié)果，是一種很有前途的基因遞送載體。圖3. 聚合物-DNA復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試(A-F)以及不同GSH濃度下復(fù)合物的DNA釋放曲線(G-I) 隨后，作者通過(guò)DLS測(cè)定了多肽-硫辛酸聚合物與pAAV-CAG-GFP質(zhì)粒(pDNA)復(fù)合物的粒徑分布與zeta電位。結(jié)果表明，P2與質(zhì)粒形成的復(fù)合物粒徑分布最均勻(圖4A)，并且在w/w=24/1時(shí)，P2與質(zhì)粒形成的復(fù)合物帶正電，與AGE結(jié)果一致(圖4B)。作者還通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)觀察了復(fù)合物的形貌，發(fā)現(xiàn)在w/w=24/1時(shí)，P2與質(zhì)粒能夠在去離子水中濃縮形成規(guī)則的球狀納米顆粒而不聚集，表明它們具有良好的穩(wěn)定性，這十分有益于基因遞送過(guò)程(圖4C)。
圖4. 聚合物與質(zhì)粒形成復(fù)合物的相關(guān)表征與結(jié)構(gòu)示意圖
作者還通過(guò)CCK-8測(cè)定法評(píng)估了不同聚合物-pDNA復(fù)合物在不同細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明P1和P2的細(xì)胞毒性最低，且遠(yuǎn)低于相同濃度下的PEI(圖5)。圖5. 不同細(xì)胞系暴露于不同聚合物-pDNA復(fù)合物的活性數(shù)據(jù)(A)293T細(xì)胞; (B)CHO-K1細(xì)胞; (C)Hela細(xì)胞 最后，作者通過(guò)基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證了質(zhì)粒能否在細(xì)胞中成功釋放與表達(dá)。如圖6所示，相比于P1和P3，P2與質(zhì)粒形成的復(fù)合物(w/w=24/1)轉(zhuǎn)染良好，整個(gè)過(guò)程中可以觀察到綠色熒光蛋白形成。圖6. 體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果 綜上所述，作者通過(guò)多肽修飾硫辛酸制備了三種多肽-硫辛酸單體及其相應(yīng)聚合物。這些聚合物可以通過(guò)側(cè)鏈帶正電荷的基團(tuán)與帶負(fù)電荷的基因組裝在一起形成規(guī)則的球形納米顆粒，且這種復(fù)合物具有低細(xì)胞毒性。這些特性賦予了多肽-硫辛酸陽(yáng)離子聚合物理想的基因遞送特性，使其有望被廣泛用作基因治療的基因遞送平臺(tái)。DOI: 10.1021/acsomega.3c07194Link: https://doi.org/10.1021/acsomega.3c07194
