分享一篇摘自Nature Chemistry上的“Proteolysis-targeting chimeras with reduced off-targets”。泊馬度胺是一種在PROTACs中廣泛使用的E3連接酶招募劑，它可以獨(dú)立降解其他蛋白，包括zinc-fnger（ZF）蛋白，在健康和疾病中發(fā)揮重要作用。這種靶向降解阻礙了基于泊馬度胺的PROTACs的治療適用性，需要開(kāi)發(fā)PROTAC設(shè)計(jì)規(guī)則來(lái)最小化靶向降解。本文作者開(kāi)發(fā)了一個(gè)高通量平臺(tái)，可以篩選基于泊馬度胺的PROTACs誘導(dǎo)的幾種ZF蛋白的靶降解。
蛋白質(zhì)水解靶向嵌合體（PROTAC）中，泊馬利度胺經(jīng)常被附加到靶蛋白結(jié)合物上，以產(chǎn)生一個(gè)分子嵌合體，誘導(dǎo)靶蛋白和CRBN連接酶復(fù)合物之間的接近。與分子膠一樣，這種接近誘導(dǎo)導(dǎo)致靶蛋白泛素化和降解。然而，這些PROTACs中的泊馬利度胺部分也可能泛素化和降解ZF蛋白，這些蛋白在正常發(fā)育和疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)功能。泊馬度胺以不依賴(lài)于PROTAC的方式降解其他蛋白質(zhì)的能力引起了人們對(duì)這些化合物脫靶泛素化和降解的不穩(wěn)定性的擔(dān)憂，因此，迫切需要一種穩(wěn)健、敏感和高通量的方法來(lái)確定這種PROTACs的脫靶降解。
圖1
為了分析泊馬度胺及其類(lèi)似物對(duì)ZF降解傾向，作者首先開(kāi)發(fā)了一種自動(dòng)成像分析方法（圖1a）。對(duì)于這個(gè)平臺(tái)，作者選擇了11個(gè)ZF蛋白的23個(gè)氨基酸ZF，這些蛋白能夠被泊馬度胺降解，3個(gè)沒(méi)有降解。將把這些ZF碎片插入到一個(gè)慢病毒降解表達(dá)載體中(cilantro 2)，來(lái)比較ZF標(biāo)記的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）與未標(biāo)記的mCherry的熒光情況。
通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，作者分析了9個(gè)已報(bào)道的PROTACs的脫靶活性，它們具有不同的泊馬度胺末端和連接子長(zhǎng)度的出口載體。觀察到幾乎所有9個(gè)PROTACs都有許多ZF結(jié)構(gòu)域的降解（圖1b）。值得注意的是，具有共同出口載體的PROTACs，如芳酰胺、芳基醚、芳基碳和芳基酰胺，通常具有類(lèi)似于波馬利度胺的更大的ZF降解能力。
圖2
為了驗(yàn)證這一成像平臺(tái)，作者使用已報(bào)道的NanoBRET檢測(cè)方法測(cè)定了PROTACs與CRBN和脫靶ZFP91形成的三元配合物的相對(duì)穩(wěn)定性（圖2a）。在這里，PROTACs誘導(dǎo)熒光素酶（附加到ZFP91）和熒光團(tuán)（通過(guò)HaloTag結(jié)構(gòu)域附加到CRBN）之間的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）。生成了一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)zfp91-納米熒光素酶（NLuc）融合的細(xì)胞系，并用halotag融合的CRBN（HT-CRBN）轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，然后用熒光團(tuán)（即NanoBRET-618配體）和PROTACs處理。觀察到PROTACs的BRET信號(hào)，表明CRBN、脫靶ZFP91和PROTACs之間形成了三元復(fù)合物（圖2b）。由于三元配合物的形成不能保證靶標(biāo)降解，作者也使用免疫印跡和全局蛋白質(zhì)組學(xué)分析證實(shí)了內(nèi)源性ZF蛋白的脫靶降解,例如已報(bào)道的PROTACs MS4078（ALK PROTAC)和dTAG-13（FKBP12F36V PROTAC，圖2d）。
總之，作者開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種基于圖像的高通量脫靶譜分析平臺(tái)，用于系統(tǒng)評(píng)估PROTAC介導(dǎo)的ZF蛋白脫靶降解，該蛋白在生物學(xué)和疾病進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。利用這個(gè)平臺(tái)來(lái)確定設(shè)計(jì)基于波馬度胺的PROTACs的規(guī)則，通過(guò)設(shè)計(jì)和測(cè)試波馬度胺類(lèi)似物庫(kù)來(lái)減少ZF蛋白的脫靶降解，這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)新的和更安全的PROTACs提供了機(jī)會(huì)，并改進(jìn)現(xiàn)有的PROTACs。
本文作者：FJY
責(zé)任編輯：FJY
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41557-023-01379-8
DOI：10.1038/s41557-023-01379-8
