分享一篇摘自Nature Chemistry上的“Proteolysis-targeting chimeras with reduced off-targets”。泊馬度胺是一種在PROTACs中廣泛使用的E3連接酶招募劑，它可以獨立降解其他蛋白，包括zinc-fnger（ZF）蛋白，在健康和疾病中發(fā)揮重要作用。這種靶向降解阻礙了基于泊馬度胺的PROTACs的治療適用性，需要開發(fā)PROTAC設(shè)計規(guī)則來最小化靶向降解。本文作者開發(fā)了一個高通量平臺，可以篩選基于泊馬度胺的PROTACs誘導(dǎo)的幾種ZF蛋白的靶降解。
蛋白質(zhì)水解靶向嵌合體（PROTAC）中，泊馬利度胺經(jīng)常被附加到靶蛋白結(jié)合物上，以產(chǎn)生一個分子嵌合體，誘導(dǎo)靶蛋白和CRBN連接酶復(fù)合物之間的接近。與分子膠一樣，這種接近誘導(dǎo)導(dǎo)致靶蛋白泛素化和降解。然而，這些PROTACs中的泊馬利度胺部分也可能泛素化和降解ZF蛋白，這些蛋白在正常發(fā)育和疾病進展中發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)功能。泊馬度胺以不依賴于PROTAC的方式降解其他蛋白質(zhì)的能力引起了人們對這些化合物脫靶泛素化和降解的不穩(wěn)定性的擔(dān)憂，因此，迫切需要一種穩(wěn)健、敏感和高通量的方法來確定這種PROTACs的脫靶降解。
圖1
為了分析泊馬度胺及其類似物對ZF降解傾向，作者首先開發(fā)了一種自動成像分析方法（圖1a）。對于這個平臺，作者選擇了11個ZF蛋白的23個氨基酸ZF，這些蛋白能夠被泊馬度胺降解，3個沒有降解。將把這些ZF碎片插入到一個慢病毒降解表達載體中(cilantro 2)，來比較ZF標記的增強型綠色熒光蛋白（eGFP）與未標記的mCherry的熒光情況。
通過此實驗，作者分析了9個已報道的PROTACs的脫靶活性，它們具有不同的泊馬度胺末端和連接子長度的出口載體。觀察到幾乎所有9個PROTACs都有許多ZF結(jié)構(gòu)域的降解（圖1b）。值得注意的是，具有共同出口載體的PROTACs，如芳酰胺、芳基醚、芳基碳和芳基酰胺，通常具有類似于波馬利度胺的更大的ZF降解能力。
圖2
為了驗證這一成像平臺，作者使用已報道的NanoBRET檢測方法測定了PROTACs與CRBN和脫靶ZFP91形成的三元配合物的相對穩(wěn)定性（圖2a）。在這里，PROTACs誘導(dǎo)熒光素酶（附加到ZFP91）和熒光團（通過HaloTag結(jié)構(gòu)域附加到CRBN）之間的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）。生成了一個穩(wěn)定表達zfp91-納米熒光素酶（NLuc）融合的細胞系，并用halotag融合的CRBN（HT-CRBN）轉(zhuǎn)染這些細胞，然后用熒光團（即NanoBRET-618配體）和PROTACs處理。觀察到PROTACs的BRET信號，表明CRBN、脫靶ZFP91和PROTACs之間形成了三元復(fù)合物（圖2b）。由于三元配合物的形成不能保證靶標降解，作者也使用免疫印跡和全局蛋白質(zhì)組學(xué)分析證實了內(nèi)源性ZF蛋白的脫靶降解,例如已報道的PROTACs MS4078（ALK PROTAC)和dTAG-13（FKBP12F36V PROTAC，圖2d）。
總之，作者開發(fā)并驗證了一種基于圖像的高通量脫靶譜分析平臺，用于系統(tǒng)評估PROTAC介導(dǎo)的ZF蛋白脫靶降解，該蛋白在生物學(xué)和疾病進展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。利用這個平臺來確定設(shè)計基于波馬度胺的PROTACs的規(guī)則，通過設(shè)計和測試波馬度胺類似物庫來減少ZF蛋白的脫靶降解，這項研究的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新的和更安全的PROTACs提供了機會，并改進現(xiàn)有的PROTACs。
本文作者：FJY
責(zé)任編輯：FJY
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41557-023-01379-8
DOI：10.1038/s41557-023-01379-8
