分享一篇最近發(fā)布在預(yù)印本上的文章，Phase-separation propensity of non-ionic amino acids in peptide-based complex coacervation systems。這篇文章的通訊作者是來自日本國立先進(jìn)工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院的Shunsuke Tomita教授。
蛋白質(zhì)的液液相分離(LLPS)在活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)劃分中起著重要作用，并且它也是地球原始生命階段原始細(xì)胞出現(xiàn)的關(guān)鍵熱力學(xué)過程，因此對(duì)于它的研究受到了廣泛的關(guān)注。LLPS的過程會(huì)形成小體積的分子凝聚相（即所謂的液滴），這些液滴富含水，但不同于水凝膠，液滴內(nèi)通常是致密的粘彈性液體（水含量40-90%，粘度0.1-100 Pa·s）。這些特征使它們能對(duì)周圍環(huán)境（如溫度、pH值和離子強(qiáng)度）實(shí)現(xiàn)快速、適應(yīng)性和可逆地響應(yīng)。此外，由于缺乏膜結(jié)構(gòu)，液液相分離允許某些低分子量或高分子量的分子有選擇地?fù)饺氲揭旱蝺?nèi)部，從而有助于生物反應(yīng)的時(shí)空控制。
生物液滴主要由蛋白質(zhì)、DNA或RNA等生物大分子組成，其中蛋白質(zhì)中的天然無序序列被認(rèn)為在LLPS中起到了重要的作用。這些LLPS過程是由多價(jià)締合作用驅(qū)動(dòng)的，尤其是靜電相互作用、π-π堆積和陽離子-π相互作用。現(xiàn)在已經(jīng)有模型來預(yù)測蛋白質(zhì)的液液相分離行為，一個(gè)代表性的例子是Stickers-and-spacers model，這個(gè)模型認(rèn)為具有相互作用的粘性殘基被可溶性的間隔殘基分開后，可以形成液滴而不是固體聚集物。
但到目前為止，盡管疏水殘基在蛋白質(zhì)折疊中起著關(guān)鍵作用，人們對(duì)于非帶電氨基酸殘基在LLPS中所起到的作用認(rèn)識(shí)甚少。在本文中，作者建立了一個(gè)用正電荷多肽與核酸之間的靜電相互作用形成LLPS的模型體系，通過在多肽上引入非離子型氨基酸來研究這些氨基酸對(duì)形成LLPS的影響。
圖1. 多肽/DNA液液相分離體系用于研究非離子型氨基酸對(duì)相分離的貢獻(xiàn)
作者設(shè)計(jì)了12種多肽K7X3，每種多肽由N段7個(gè)賴氨酸和3個(gè)非離子型重復(fù)氨基酸組成。作者將這些多肽與單鏈DNA (dA15)復(fù)合，來研究非離子型氨基酸對(duì)LLPS的影響。這些多肽在溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)均為無規(guī)卷曲，因此可以忽略高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)LLPS的影響。
K7G3和dA15的相圖表明（圖1b），在pH = 7的50 mM HEPES緩沖液和10%聚乙二醇 (PEG) 的存在下，在K7G3濃度高于40 μM和特定的dA15濃度范圍內(nèi)，才會(huì)形成液滴狀凝聚物。在這些濃度范圍內(nèi)，作者未觀察到固態(tài)聚集體。不僅K7G3，K7X3多肽與dA15在等電荷比時(shí)均可形成液滴狀凝聚體。延時(shí)圖像證明了相鄰兩個(gè)液滴之間可以發(fā)生融合，并且作者用光漂白后熒光恢復(fù)(FRAP)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)液滴內(nèi)分子的流動(dòng)性（圖2b,c）。作者認(rèn)為可以通過確定產(chǎn)生液滴時(shí)的最低多肽濃度，并將這些值與K7G3比較，從而定量評(píng)價(jià)氨基酸的貢獻(xiàn)。
圖2. 非離子型氨基酸在與ssDNA形成液滴中的作用。(a) K7X3/dA15正負(fù)電荷比為1.0的明場顯微圖。(b) K7G3/dA15液滴的聚集。(c) 光漂白熒光恢復(fù)(FRAP)實(shí)驗(yàn)。(d) 比濁度滴定實(shí)驗(yàn)。(e) 由圖d得到的臨界電荷比Ccrit。
為了量化K7上的三肽X3對(duì)LLPS的影響，作者用dA15溶液滴定K7X3，監(jiān)測溶液的比濁度（圖2d），將濁度開始增加時(shí)的電荷比定義為臨界電荷比Ccrit，較小的Ccrit表明誘導(dǎo)LLPS所需的肽濃度較低。由圖2e可知，具有芳環(huán)的氨基酸可以非常有效地誘導(dǎo)LLPS，而疏水性較強(qiáng)的脂肪族氨基酸相對(duì)不容易誘導(dǎo)LLPS。
作者發(fā)現(xiàn)，在排除芳香族氨基酸時(shí)，Ccrit與氨基酸殘基的親疏水性成正相關(guān)，即疏水性越高，越不容易誘導(dǎo)LLPS（圖3）。這可能是由于疏水側(cè)鏈越大，有效溶劑化體積會(huì)增加，使相分離狀態(tài)不穩(wěn)定。
圖3. K7X3/dA15溶液的Ccrit值與氨基酸參數(shù)的擬合與比較
作者使用其他種類DNA鏈驗(yàn)證該結(jié)果的普適性，結(jié)果表明這些多肽在與核酸復(fù)合時(shí)均有類似的趨勢，即芳香族氨基酸特別容易誘導(dǎo)LLPS，但疏水性大的脂肪族氨基酸相對(duì)會(huì)抑制LLPS。芳香族氨基酸能夠有效誘導(dǎo)LLPS的原因在于其能與堿基發(fā)生π-π堆積作用，因此增加了多價(jià)的相互作用。作者用聚甲基丙烯酸代替核酸做了相同的實(shí)驗(yàn)，與甘氨酸相比，色氨酸和苯丙氨酸會(huì)對(duì)LLPS產(chǎn)生抑制。
總的來說，在這篇文章中，作者建立一個(gè)利用多肽和核酸復(fù)合形成LLPS的模型體系，并利用該模型發(fā)現(xiàn)：1. 非離子氨基酸會(huì)抑制LLPS，并且隨著側(cè)鏈?zhǔn)杷缘脑黾?，抑制作用?huì)增強(qiáng)；
